실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Purification/Isolation
Spleen에서 trizol 사용시 RNA 수율이 잘 나오는 방법이 있을까요?
레벨1 Eeveee (대학원생)
안녕하세요.
Mouse spleen에서 trizol로 RNA를 뽑는데 수율이 너무 낮아서 조언을 구합니다ㅠㅠ
FACS sorting 후 RNA를 뽑아 RT-PCR을 진행하려고 합니다. Sorting 후에 cell이 5 x 10^5 cell/ml 정도라서 우선 spleen을 single cell suspension하고 whole splenocyte에서 연습을 하고 있습니다. 잘 나오면 100 ng/ul 정도 나오는데 혹시 더 많이 뽑는 방법이 있을까요?
아래의 프로토콜로 진행하고 있습니다!
1. Add 1 mL of Trizol and vortex for 10 seconds.
2. Incubate for 5 minutes.
3. Add 0.2 mL of chloroform, then securely cap the tube.
4. Incubate for 3 minutes.
5. Centrifuge the sample for 15 minutes at 12,000 × g at 4°C.
6. Transfer the aqueous phase containing the RNA to a new tube.
7. Add 0.5 mL of isopropanol to the aqueous phase.
8. Incubate for 10 minutes.
9. Centrifuge for 10 minutes at 12,000 × g at 4°C. and discard the supernatant.
10. Resuspend the pellet in 1 mL of 75% ethanol.
11. Centrifuge for 5 minutes at 7500 × g at 4°C and discard the supernatant.
12. Vacuum or air dry the RNA pellet for 5 minutes.
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