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Western blot sample preparation 시 protein 농도가 낮게 나오는 문제의 해결방안
레벨1 서롤 (과기인)
안녕하세요. 화학과에서 western blot 실험을 진행중인 한 대학원생입니다.
이 글을 작성하는 이유는 제목에도 적혀있듯이 제가 항상 western blot sample을 preparation하는 과정에서 최종 BCA assay를 통해 얻는 protein의 농도가 너무 낮은 점에 대한 해결책을 찾고 싶어서 입니다.
우선 저희 연구실에서는 western blot용 cell seeding을 12 well에 1.0x105개 하여왔습니다(thermo plate seeding density를 기준으로 한 것). Media는 DMEM/F-12를 사용하였고 culture volume은 1 mL였습니다. seeding 후에는 24 시간 culture 후, 기존의 media를 suction하여 주고 compound를 녹인 media (final DMSO 0.1%) 1 mL를 넣어 추가로 8시간 혹은 24 시간 culture를 진행하였습니다.
그리고 time point에 따라 그 시간이 되면, media를 제거한 후 ice-cold PBS, 500 µL로 3번의 wash를 진행하고, 100 µL의 Lysis buffer를 treat하여 4 도씨에서 30분간 agitation진행하였습니다. 그 후, 현미경으로 모든 세포가 떨어진것 및 세포벽의 형태가 사라진 것을 확인한 다음, scrapping하여 1.5 mL tube에 담아 16000 g에서 40분간 centrifuge합니다. 최종적으로 sup.을 따서 BCA assay를 진행하는 식으로 진행하게 됩니다.
그 결과 저희는 최대 0.6 mg/mL 정도의 단백질 농도만을 얻을 수 있었는데, 다른 실험자 분들의 예시를 여기저기서 찾아보면 이보다 월등히 높은 농도로 (20~30 mg/mL) lysate를 얻고, 실제 WB의 protein loading amount도 40~50 µg 정도 되는 것을 보면 저희의 lysate 농도가 매우 묽음을 항상 느낄 수 있었습니다.
Lysis buffer는 thermo의 RIPA buffer (Cat#: 89900)과 merck사의 Roche cOmplete Mini tablet (11836143001) 제품을 mix하여 만들어 줍니다.
cOmplete Mini tablet의 경우는 1 tablet을 1.5 mL DW나 100 mM phosphate buffer에 녹이면 7x 농도라서 이를 RIPA와 6:1로 mix하여 사용합니다.
이때 RIPA에 포함된 1% NP-40이 묽어져서 그런것인가 생각되어 애초에 tablet을 RIPA buffer에 녹여 lysis buffer를 만들어 사용도 해보았지만 농도는 똑같이 묽었습니다.
혹시 이런 현상을 겪어보신 적이 있으신 분이거나 이 현상에 대한 해결책이 떠오르시는 분은 조금만 지혜를 빌려주시면 감사하겠습니다.
항상 sampling을 할때마다 농도가 낮게나와서 실험을 진행하지 못하는 것이 너무 답답하기만 한 상황입니다. 해결책을 찾고싶습니다.
읽어주셔서 감사합니다.
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