실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
westernblot membrane이 왜이럴까요? ㅠㅠㅠㅠ제발도와주세여....
레벨3 dbkorea (과기인)
안녕하세요
westernblot 하는데 사진처럼 membrane이 자꾸 어둡게 나와서 뭐가 문제인지 모르겠습니다 ㅠ
b-actin은 계속 잘나오는데 나머지Ab들이 자꾸 안나옵니다.
원래 blocking 시간은 1시간, RT 했는데 이번엔 2시간 했고,
1차Ab 농도도 1:1000했는데 1:800으로 늘렸구요, 4도씨 콜드룸에서 O/N했습니다.
워싱은 TBST이용하는데, 짧게 자주 교체해주라고 하시는 분이 계셔서 원래는 10분씩 3회 하는데 8분씩 5회 했고, rpm 도 더 세게 늘렸습니다.
2nd Ab는 원래 1:5000에서 1:10000으로 낮췄습니다. 아, 2nd Ab 하기 전에 re-blocking이 불필요한 detection 없애준다고 해서 10분정도 blocking 했구요.
그러고 나서 8분 5회 워싱 후 LAS 촬영했습니다.
도대체 뭐가 문제인지 모르겠습니다.
심지어.. 이번엔 IL-10이 그 전에는 membrane어둡고 멀티밴드가 나왔는데,
이번에 촬영해보니 군데군데 구멍도 나있고 두번째 membrane에는 그을린 것 같이 일부가 없어져서 나왔더군요...
사진마다 2개의 membrane 중 위의 것끼리는 같은 membrane이고 아래의 것 끼리는 같은 membrane입니다만, 다른 membrane은 다 괜찮은데 IL10은 왜 저런 구멍이 난걸까요 ㅜ
membrane 어두운것, 멀티밴드, IL10의 밴드 손상 제발 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
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