- V:I 비율은 몰비율인가요?
- ligation에 사용한 vector만 ligation 하지 않고 TF하면 colony가 나오지 않나요?
- 몇 번 실험하다가 positive clone이 안나올 경우 다시 질문을 올려주면 100% 가능한 방법을 공유하겠습니다.
blunt end ligation은 two-step ligation도 해볼만 합니다.
과량의 vector와 과량의 insert를 ligation시킨다.
gel에 걸어본다.
marker / vector / insert / ligation 순으로 걸어보면 ligation 한 DNA의 크기 (2.7kb + 1.2kb = 3.9kb)의 밴드가 나옵니다. 물론 과량의 DNA를 사용했으므로 주로 linaer ligation이 되고 여러 조합의 크기가 나오겠지만 3.9kb 밴드만 elution한 다음 두번째 ligation을 하면 아무래도 DNA 농도가 낮아져서 circular ligation이 더 잘됩니다.
이렇게 해서 transformation을 하면 나오는 colony는 100% insert가 들어간 clone입니다.
Haemophilus influenzae genome project 논문의 marerial and method에 보면 자세한 설명이 있습니다.
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레벨3
구릅
(대학생)
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22.12.01 17:22
- V:I 비율은 몰비율인가요?
vector 100ng * Insert size (kb)
---------------------------------- x 10/1 를 뜻합니다.
vector size (kb)
- ligation에 사용한 vector만 ligation 하지 않고 TF하면 colony가 나오지 않나요?
vector_Sma1 한거는 따로 TF 해보지 않았습니다.
vector 자체 TF colony 나옵니다.
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레벨3
구릅
(대학생)
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22.12.01 17:25
강시님
과량의 vector와 과량의 insert를 ligation시킨다고 하면 보통 어느 정도하시나요?
예를 들어 1000ng vector 이상 기준으로 ligation 수식 대입해서 나오는 insert ng으로 하면 될까요?
- 다른 방법 알려주셔서 감사합니다. 논문 읽고 말씀하신거 참고해서 디자인 짜볼게요
- 100% SmaI으로 잘린 vector만 사용하는지 확인하세요.
- Background로 colony가 우선적으로 나옵니다.
- 말단 비율은 1 : 4 정도면 blunt도 충분합니다.
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레벨3
구릅
(대학생)
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22.12.01 19:42
Vector CCC와 Sma1로 처리했을 때 완전히 잘리는 걸 전기영동 상에서 확인하고 진행한거였는데 잘리지 않은 vector가 포함될 수 있겠군요...
SPEED님 100% 잘린 vector 확인이라 함은 TF로 확인하라는 말씀이죠?
TF 후 colony가 안올라와야 100% 잘린 vector 구요
네.
cloning 할때 background colony를 줄이기 위해 vector자른 후 ccc form이 남아있는지 확인하는 것이 좋습니다.
확인 방법은 자른 vector를 준비한 후 ligation 하지 않고 TF 해서 자란 colony가 안나오면 좋습니다.
구름님.
벡터 2ug 을 사용하고 insert도 2ug 사용하면 됩니다.
왜냐하면 어차피 insert는 concatemer를 만들기 때문에 실제 클로닝에는 2ug insert중 일부가 사용됩니다. 그리고 vector하나와 insert하나가 결합된 것을 마커와 크기비교로 확인해서 elution하면 됩니다.
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레벨3
구릅
(대학생)
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22.12.02 15:43
두 분다 자세히 알려주셔서 감사합니다. 위에 알려주신 방법 토대로 실험해보겠습니다.
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레벨2
Steady
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22.12.05 11:18
Cloning 과정에서 중요한 Vector 및 Insert size와 농도입니다.
보통 Cloning 최적의 조건은 Vector:Insert=1:3 ratio입니다.
Google에 Ligation Calculator 검색하셔서 들어가시면 Vector 및 Insert size, Vector 농도, 원하는 ratio를 기입하면 필요한 Insert 농도를 알려줍니다.
이를 참고하여 Vector 및 Insert 조건 맞춰보시길 바랍니다.
Ligation할 때 필요한 materials은 Vector, Insert, Ligase, Ligation buffer가 충족되어야합니다.
vector : phosphase 처리 필요합니다.
insert: kinase 처리 필요합니다.