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template가 어떤 종류이고 primer는 어떻게 디자인했나요?
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레벨1
Cheddar
(대학생)
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22.12.01 10:39
어류에서 total RNA를 분리해 cDNA 합성한 것을 template로 사용했고, primer은 기존에 실험실에서 있던걸 사용했습니다.
사용한 primer로 예전에 증폭이 잘 되었나요?
다른 유전자가 검출된 건가 싶어 Gel extraction, TA-cloning후 prep 해서 sequencing을 보냈는데 결과에서 다른 유전자가 아닌 T-vector로 나옵니다.
=> cloning이 되었는지 확인이 되지 않은 상태에서 sequencing을 보낸것이 아닌가 싶군요.
가능하다면 gradient PCR롤 해 보시지요.
아니면 primer를 다시 디자인하거나 cDNA가 제대로 만들어졌는지도 확인해볼 필요가 있어보입니다. 가령 house keeping gene이 잘 PCR 증폭되는지 확인하는 정도.....
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레벨2
Steady
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22.12.05 10:44
T-vector로 Clonging 하신거면, Cloning 됐는지 확인하기 위해 enzyme cutting으로 확인해보시는게 좋을 것같네요. ( 물론, 사용하신 primer에 enzyme site가 있을때 )
Sequencing을 보냈는데 T-vector로 나온거면 Cloning이 되지 않은 것같습니다. 그리고 보통 TA-cloning을 하고 Sequencing을 보낼 때 개인적으로 design한 priemr를 보낼 필요 없는걸로 알고있어요. 마크로젠의 경우 TA-cloning한 DNA sequence 확인용 primer(SP6&T7)를 가지고 있는 것으로 알고있습니다.