실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
SDM 안되는 polymerase도 있나요?
레벨2 neuronal plasticity (대학원생)
이전에 SDM(Site-directed mutagenesis) 관련하여 질문을 올렸었습니다.
(https://www.ibric.org//myboard/read.php?Board=exp_qna&id=789382)
골자는 SDM이 되지 않는 것에 대해서 조언을 구하는 글이었는데.. 결국 성공하긴 했습니다만, 여전히 매우 낮은 효율때문에 다시 질문을 올리게 되었습니다.
현 상황을 요약하면 다음과 같습니다.
vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고,
primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.
snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것이며, Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 맞춰준다고 합니다.
PCR mixture :
total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 500ng (기존 200ng)
PCR cycle :
95°C 30s
95°C 30s
55°C 60s
68°C 4:30s (기존 kb/30s 에서 kb/1min로 수정)
step 2부터 X 18
68°C 13:00
PCR이 완료되면,
바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation
그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 120min (기존 40min) 돟안 shaking incubation
마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading
빨간색으로 표기한 부분이 저번 질문에서 올린 protocol과 다르게 한 부분입니다.
이렇게 수행하였더니 colony 3개를 얻을 수 있었습니다.. 물론 sanger 돌려보니 SDM 확인은 잘 됐는데요,
고작 3.5kb로 매우 작은 vector에서, 그것도 base 하나 바꾸는데 이렇게 효율이 안나오는 것도 이상하고, 이런 상태라면 더 큰 vector에서 a.a를 바꾸는 경우에는 아예 colony가 안뜰 것 같다는 걱정이 됩니다.
그래서 지금 문제를 찾고 있는데..
우선 총 2종류의 pfu기반의 high fidelity polymerase로 test를 진행하였습니다.
조건은
template 200ng
template 500ng
template 500ng+DMSO 로 잡고 진행하였습니다.
PCR 직후의 gel 사진을 보시면 (이때는 깜빡하고 control로 template을 걸지 못했습니다.. ㅠ) TOYOBO의 polymerase의 band intensity가 훨씬 높습니다.
사실 TOYOBO가 thermo보다 activity가 훨씬 높다는 건 기존에 잘 알고 있어서 해당 결과는 충분히 납득할 수 있었습니다.
Dpn1 4hr 처리 이후의 gel 사진입니다.
여전히 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높습니다. 해당 결과만 보면 무조건 TOYOBO에서 colony가 잘 떠야하는데..
결과는 thermo : template 500ng (w/o DMSO) 조건 딱 하나에서만 3개의 colony를 얻을 수 있었습니다.
저는 이 결과가 도저히 이해가 가질 않네요.
분명히 Dpn1 처리 이후, transformation 직전에 gel 사진에서는 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높은데, 정작 되는건 thermo에서, 그것도 매우매우 낮은 효율로 되는게 이상합니다.
본문에서 진행한 실험 말고도, 여태까지 try를 모두 TOYOBO로 했었는데 전부 안되는 것으로 보아 현재까지는 SMD을 수행하는데 있어 TOYOBO polymerase가 부적합 하다고 밖에는 생각되지 않습니다.
그래서 TOYOBO maual을 잘 찾아보니까..
해당 pol에는 3' exonuclease activity가 있다고, enzyme cut 하기 전에 purify하라고 나와있는데, 이것 때문일까요..?
근데 3' exo activity는 pfu 기반이면 다 있을 수 밖에 없는 건데, (klenow fragment가 아닌 이상에야) 왜 TOYOBO만 그런걸까요..
관련하여 선생님들의 조언과 의견을 여쭤보고 싶습니다.
감사합니다.
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