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질문 SDM 안되는 polymerase도 있나요?
올챙이neuronal plasticity(대학원생)  | 2022.11.29 13:15

이전에 SDM(Site-directed mutagenesis) 관련하여 질문을 올렸었습니다.

(https://www.ibric.org//myboard/read.php?Board=exp_qna&id=789382)

 

골자는 SDM이 되지 않는 것에 대해서 조언을 구하는 글이었는데.. 결국 성공하긴 했습니다만, 여전히 매우 낮은 효율때문에 다시 질문을 올리게 되었습니다.

 

현 상황을 요약하면 다음과 같습니다.

 

upload_image

 

vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고,

 

primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.

 

snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것이며, Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 맞춰준다고 합니다.

 

 

PCR mixture :

total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 500ng (기존 200ng)

 

PCR cycle : 

95°C 30s

95°C 30s

55°C 60s

68°C 4:30s (기존 kb/30s 에서 kb/1min로 수정)

step 2부터 X 18 

68°C 13:00

 

PCR이 완료되면,

바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation 

 

그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 120min (기존 40min) 돟안 shaking incubation

 

마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading

 

 

 

빨간색으로 표기한 부분이 저번 질문에서 올린 protocol과 다르게 한 부분입니다.

 

이렇게 수행하였더니 colony 3개를 얻을 수 있었습니다.. 물론 sanger 돌려보니 SDM 확인은 잘 됐는데요,

 

고작 3.5kb로 매우 작은 vector에서, 그것도 base 하나 바꾸는데 이렇게 효율이 안나오는 것도 이상하고, 이런 상태라면 더 큰 vector에서 a.a를 바꾸는 경우에는 아예 colony가 안뜰 것 같다는 걱정이 됩니다.

 

그래서 지금 문제를 찾고 있는데..

 

 

upload_image

 

우선 총 2종류의 pfu기반의 high fidelity polymerase로 test를 진행하였습니다.

 

조건은

template 200ng

template 500ng

template 500ng+DMSO 로 잡고 진행하였습니다.

 

PCR 직후의 gel 사진을 보시면 (이때는 깜빡하고 control로 template을 걸지 못했습니다.. ㅠ) TOYOBO의 polymerase의 band intensity가 훨씬 높습니다.

 

사실 TOYOBO가 thermo보다 activity가 훨씬 높다는 건 기존에 잘 알고 있어서 해당 결과는 충분히 납득할 수 있었습니다.

 

 

 

 

 

upload_image

 

Dpn1 4hr 처리 이후의 gel 사진입니다.

 

여전히 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높습니다. 해당 결과만 보면 무조건 TOYOBO에서 colony가 잘 떠야하는데..

 

결과는 thermo : template 500ng (w/o DMSO) 조건 딱 하나에서만 3개의 colony를 얻을 수 있었습니다.

 

 

저는 이 결과가 도저히 이해가 가질 않네요.

 

분명히 Dpn1 처리 이후, transformation 직전에 gel 사진에서는 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높은데, 정작 되는건 thermo에서, 그것도 매우매우 낮은 효율로 되는게 이상합니다.

 

본문에서 진행한 실험 말고도, 여태까지 try를 모두 TOYOBO로 했었는데 전부 안되는 것으로 보아 현재까지는 SMD을 수행하는데 있어 TOYOBO polymerase가 부적합 하다고 밖에는 생각되지 않습니다.

 

그래서 TOYOBO maual을 잘 찾아보니까..

 

 

 

upload_image

 

해당 pol에는 3' exonuclease activity가 있다고, enzyme cut 하기 전에 purify하라고 나와있는데, 이것 때문일까요..?

 

근데 3' exo activity는 pfu 기반이면 다 있을 수 밖에 없는 건데, (klenow fragment가 아닌 이상에야) 왜 TOYOBO만 그런걸까요..

 

 

 

 

관련하여 선생님들의 조언과 의견을 여쭤보고 싶습니다.

 

감사합니다.

#Site-directed mutagenesis
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
앞다리실험은안될때가더많아  |  2022.11.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

지난번에 답변드렸던 사람 중 하나입니다.

먼저 KOD는 pfu기반이 아닙니다. Phusion은 pfu에 추가된 것이 맞지만 KOD는 Thermococcus kodakaraensis 의 polymerase이죠

improved 된 phusion이나 KOD는 말씀하신대로 extension time을 늘릴필요는 없었을 것 같습니다.

지난번에 primer design을 못봤었는데요. 해당 design은 QuickChange에서 추천했던 방법인데 이후 다른 곳들에서 3`overlap 도입을 추천하였습니다. 6~8 basepair overlap이 없다면 nicked circular form을 유지할 가능성이 낮아지기 때문이죠

upload_image

https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1472-6750-8-91

 

PCR product들이 아래처럼 대부분 linear form으로 완성 되었기에 transformation 효율이 낮았던 것같습니다.

upload_image

https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/applications-and-technical-notes/mutagenesis-with-in-fusion-cloning

이상태에서라면 gibson assembly based cloning(gibson, NEBuilder, In-Fusion 등)을 진행해버리면 plasmid가 완성되긴 합니다.

이러한 까닭으로 mutagenesis가 잘 안되었던 것은 아닌가 조심스럽게 생각합니다.

아래는 addgene의 mutagenesis primer design에 관한 blog 글입니다.

Primer Design

As a rule of thumb, 11 bp of complementary sequence on either side of the desired mutation (usually 1-3 mismatched bases) is sufficient for your primers to successfully anneal to the plasmid of interest during the PCR reaction. Ideally, your primers should be free of palindromic and repetitive sequences, but if present, a minor extension can usually ensure that the 3’-base(s) do not form secondary structures. The introduction (or ablation) of a restriction site through mutagenesis vastly facilitates the subsequent process of screening for succesfully mutated clones. Forward and reverse primers are designed to be complementary, but each primer may extend beyond the complementary region as long as an overlap with a minimum 6 bp is maintained. This overlap ensures that the PCR generates a nicked circle rather than a linear product (see figure).

https://blog.addgene.org/site-directed-mutagenesis-by-pcr

올챙이neuronal plasticity  |  2022.11.30   

실험은안될때가더많아  님께

 

그렇다면 왜 특정 polymerase에서만 nicked circular form이 유지가 되는걸까요..

 

일단 말씀드린대로 primer를 다시 design해서 test 해 보도록 하겠습니다.

 

감사합니다.

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