실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > etc.
RNA gel electrophoresis 및 mRNA in vitro transcription 관련 질문입니다.
레벨5 실험은안될때가더많아 (과기인)
안녕하세요 일전에 in vitro transcription 결과에 대해 여쭈어본적이 있습니다.
답이 따로 안 올라왔었는데 추가 실험을 진행한 뒤 다시 고견을 여쭈러 왔습니다.
저는 6.5knt mRNA를 합성하게 되었고 UTP는 더 나은 translation을 위하여 N1-Methylpseudouridine-5'-Triphosphate로 교체하여 진행하였습니다.
LiCl precipitation 이후 size확인을 위해 sample을 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, Bromophenol Blue 버퍼에 희석하여 70도에서 10분간 denaturation을 하여 2% agarose gel에 달렸습니다.
사진의 좌측이 결과구요 RNA ladder와 비교해봤을때 6.5knt가 대충 맞는 것 같습니다.
여러번 확인하는걸 좋아하는 터라 formaldehyde denaturing agarose gel에서도 달려보았는데 이번에는 6knt보다 아래에서 확인이 되더라구요. (사진의 가운데)
이상하게 생각해서 다르게 확인할 방법이 없나 하여 실험실에 있는 Reverse transcriptase master mix가 생각났습니다. master mix가 아니라 따로 되어있는 제품이면 oligo(dT) 만 이용하였을 텐데 oligo(dT)와 random hexamer가 섞여있는 제품이라 그냥 진행하였습니다.
RNase H가 포함되어 있지 않은 제품이라 예상대로 major band는 6.5kb근처에서 나왔는데요.
제 궁금증은 왜 가장 정확하다고 생각되어지는 denaturing agarose gel에서의 결과만 다른 결과를 가르킬까요?
이후 transfection진행한 실험에서 제대로 working하는 것이 확인 되어서 중요한 상황은 아닙니다만 다음에 새로운 mRNA 합성을 하였을 때는 TBE-urea-PAGE를 진행하는 것이 가장 정확할까요? 항상 좋은 의견들 감사합니다.
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