실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
Site-directed mutagenesis 안되는 이유..
레벨2 neuronal plasticity (대학원생)
안녕하세요.. 현재 Site-directed mutagenesis를 하고있는데 colony가 안떠서 난항을 겪고 있습니다..
vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고, primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.
snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것입니다.
Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 한다는데.. 무튼 protocol은 다음과 같이 하였습니다..
PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 200ng
PCR cycle :
95°C 30s
95°C 30s
55°C 60s
68°C 2:30s (1kb/30s로 조금 넉넉하게 줬습니다.)
step 2부터 X 18
68°C 13:00
PCR이 완료되면,
바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation
그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 40min 돟안 shaking incubation
마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading
제가 예~전에 해당 protocol로 했을 때는 잘 했었던것 같은데,
그때랑 달라진건 polymerase 종류 (회사) 정도?
그래서 사실 high fidelity Pfu 다른 회사 2종류로 test 해봤는데도 역시 안뜨더군요..
무엇이 문제일까요...
선생님들의 지식을 조금만 나누어주시면 감사드리겠습니다.. ㅠㅠ
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