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질문 IPTG induction에 문제가 있습니다.
알SGKIM(대학원생)  | 2022.11.22 19:59

안녕하세요.

 

현재 target enzyme을 발현하여 기능을 보고자 pET28(+)a에 삽입한 insert gene을 E.coli BL21(DE3)에 transformation하여 IPTG 1mM 농도로 induction 후 발현이 되는지를 실험중입니다.

총 3가지의 후보 target gene을 동일한 vector와 strain을 사용하여 induction하였는데 한가지 target gene은 induction도 과량으로 잘 되었고 soluble 하게 잘 발현이 되었는데요

나머지 2개의 target gene은 전혀 induction이 되지 않는것으로 보입니다.

genscript를 이용하여 codon usage bias를 검토 하고자 CAI값을 확인였는데 잘 발현이 된 효소와 잘 되지 않은 효소의 CAI가 모두 0.68 ~ 0.72 수준으로 별 차이가 없었습니다.

 

앞으로 IPTG농도의 변화, induction 시간 변화, transformation을 다시 하는 방법등을 계획중에 있습니다.

 

혹시 이러한 방법 말고도 제가 확인해보면 도움이 될 요인들이 있다면 소중한 조언을 구합니다.

 

감사합니다.

#iptg induction
 
#pET system
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2022.11.23   

pET 벡터에 클로닝한 유전자들의 발현은 어떤 유전자가 클로닝 되었는지에 따라서 다양하게 나타납니다.

codon bias는 크로닝하면서 다 해결하지요.

보통 제일 먼저 IPTG 농도와 처리 시간을 바꿉니다.

그 다음 induction 온도를 30도, 25도 정도로 낮춰봅니다.

 

그래도 안되면 codon 하나하나를 확인해 보세요. 종종 BL21 이 사용하지 않는 codon이 클론에 포함된 경우가 있습니다. 그것만 바꿔줘도 발현 수준이 조금은 달라질 수 있습니다.

 

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