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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 단백질 전기영동 밴드 끌림 현상 관련 질문드립니다.
알ㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎ(대학원생)  | 11.21 14:39

안녕하세요 

단백질 전기영동 실험을 진행하고 있는데, 

계속 밴드 끌림 현상이 생기고 있고 ㅠㅠ 여러 troubleshooting을 진행해보았으나 소용이 없어서 western blot 고수님들의 조언을 구하고자 합니다. 

 

실험 조건은 다음과 같습니다. 

1. C57BL/6 마우스 대장 조직 homogenate(상등액)

2. lane당 단백질 20 ug 

3. Homogenate 샘플을 SDS loading buffer와 섞은 후 100도에서 15분 가열 

4. lane당 샘플 10 ul씩 로딩 

5. 전기영동 조건 200 V, 35분 

6. Gel: bio-rad  Mini-PROTEAN TGX gels (10%) 

 

Running buffer도 늘 새로 만들어서 충분한 양을 넣어서 실험하고 있고, 

Gel 밑의 테이프도 잘 떼어서 사용하고 있습니다. 

 

사진도 첨부하였으니 

조건과 결과에서 제가 혹시 놓치고 있는 부분이 있는지 코멘트해주시면 정말 감사하겠습니다!! 

upload_image

#전기영동
 
#Western blot
 
#단백질
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리CBD 김선우  |  11.21 14:49  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

sample buffer를 넣고 heating 하는 과정은 95도 5분이면 충분합니다. 15분은 좀 과하지 않을까 싶네요.

대왕개구리SPEED  |  11.21 15:44  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- BPB line을 보면 sample or gel 상태가 좋지는 않습니다.

 

- 전기영동 속도를 조금 줄이세요.

개구리차몬드  |  11.21 15:45  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

저는 90도에서 15분 끓이고 있습니다

그런데 loading 전압이 너무 높아요...!!!

저는 running gel은 120V~180V로 하고 있어요

200V까지도 하긴 한다는데 좀 높은거 같아요

전압이 높을수록 smile band가 많이 생기더라구요

알ㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎ  |  11.21 17:29  

네 답변주신 분들 모두 정말 감사합니다 ㅠㅠ 

조언해주신 내용들 참고하여 troubleshooting 다시 해보겠습니다.  

 

감사합니다!! 

뒷다리필1  |  11.22 09:23  

다른것보다.

샘플 만들때 잘못 만들어짐.

버퍼 피에치가 안받거나. 

 

 

헤우니  |  11.25 18:05   

1. sample 만드실때 centrifuge 돌린후 pellet(cell찌꺼기) 이 딸려들어가서 일수 있어요

2.gel 만드실때 stacking gel 부분이 너무 짧아서일수도 있어요.

3.200V는 너무 쌘거같아요. 저희 실험실기준 stacking gel 90v (약 30분) marker가 나눠지기 시작하면 130v 1h 합니다.  너무 쌔면 잘 안나뉘어 질수도 있어요.

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