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- His가 정확히 붙어 있나요?
- 사용 resin양과 붙인 단백질 양이 어떻게 되나요?
- binding과 washing에서 이미다졸을 넣지 않고 한번 해보세요.
- 그래도 뭔가 His가 안붙어 있는 느낌이 듭니다.
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레벨1
응앵애
(대학생)
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22.11.18 12:26
사용한 레진은 2ml, 사용했던 단백질 양은 4ml입니다 각 버퍼들은 한번에 4ml씩 흘려내렸습니다
His가 안붙어있는 것은 아닌 것 같습니다 ㅠㅠ 다른 선배가 했을 땐 잘됐었고,,
동기가 같은 버퍼로 다른 단백질을 내려봤는데 그 단백질 또한 Elution이 되지 않았습니다 .. 그래서 버퍼의 문제라고 생각하였습니다
- 사용한 단백질양이라는 뜻은 부피가 아니라 무게단위를 얘기하는 겁니다.
- 단백질에 문제가 없다면 elution에서 거의 안나올 수는 없을 겁니다.
- 각 단계에서 사용한 buffer는 총 몇ml인가요?
- 사용한 buffer 조성이 어떻게되나요?
- sample은 어떻게 만들었나요?
- resin은 새 제품인가요?
- binding, washing에서 이미다졸을 0mM로 해서도 안붙으면 단백질에 문제가 있을 가능성이 높습니다.
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레벨1
응앵애
(대학생)
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22.11.18 12:47
Binding, Wash, Elution buffer의 경우 20mM sodium phosphate(dibasic), 300mM sodium chloride는 동일하고 immidazole의 농도만 10mM, 25mM, 250mM로 다릅니다
pH는 HCl을 첨가해 낮춰주어 7.4로 맞췄습니다
바인딩 버퍼의 경우 맨 처음 4ml을 넣고 레진을 적셔 15분 기다린 뒤 버퍼를 내리고
단백질 샘플과 바인딩 버퍼를 각각 4ml씩 섞은 후 혼합액을 레진에 넣고 15분정도 기다린 뒤 내리고 내려온 용액을 다시 레진에 넣고 내렸습니다
그후 wash버퍼 4ml씩 넣고 내렸으며 총 3번 내렸습니다
Elution도 4ml씩 총 3번 내렸습니다
Sample은 stock cell을 따서 프리컬쳐 한 후
메인컬쳐 해서 OD값을 0.5-0.6정도로 키워 IPTG를넣고 16시간 인큐베이팅 했습니다
그후 센트리를 돌려 셀다운 해 PBS로 3번 워싱해준 후에 PMSF 처리도 하고 sonication도 진행했습니다
그 후 1시간동안 ice에서 incubating, 센트리 돌린 후 SP을 따서 다시 센트리 돌리고 나온 SP를 갖고 히스텍을 진행하였습니다
사용한 단백질의 무게 단위.. 를 여쭤보셨는데 무엇을 여쭤보시는건지 잘 이해가 안가네요
레진은 한번 사용했던 것이며 protocol에 나온 regenerate 방법에 따라서
20mM의 MES 20ml을 넣고 내리고, 20ml의 3DW를 넣고 내린 후 마지막으로 2ml의 20%에탄올을 넣어 보관해두었습니다
- binding bufffer에서 cell lysis했나요?
- phosphate buffer는 monodasic + dibasic으로 pH를 조정합니다.
- 단백질양은 말 그대로 부피가 아니라 g, mg, ug단위를 뜻합니다.
- wahing보다 recharge를 해서 사용해 보세요.
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레벨1
응앵애
(대학생)
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22.11.18 13:11
lysis는 PBS를 사용하여 진행했습니다
pH를 맞출 때 HCl이나 NaOH를 사용하라고 하셨는데 그렇게 할 경우 버퍼에 영향이 갈까요?
일단 레진을 새로 만들고 buffer 이미다졸 농도도 조정해서 한번 해봐야겠습니다ㅠㅠ
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anruid
(비회원)
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22.11.18 14:55
실험실에 다른 사람이 정제해둔 his-tag 달려 있는 단백질을 좀 얻으셔서
님이 사용하고 계신 binding buffer에 녹인 다음에
님이 사용하고 계신 정제방식에 맞춰서 정제해보시면 좋을 것 같네요.
문제 없이 정제가 잘 되면 님 단백질이 제대로 잘 안 만들어진거고
그것마저 정제가 안되면 님 정제 조건이나 버퍼제조가 잘못된 거겠죠?
하나 궁금한게 binding buffer에서랑 washing buffer에서 단백질이 거의 추출됬다고 하셨는데 단백질이 거기 있는지 검출을 형광으로 하신건지 아니면 그냥 브래드포드로 하신건지 모르겠습니다.
만약에 브래드 포드로 하신거라면 아무 의미가 없는게<br />
당연히 flowthrough와 wash에서는 님이 원하는 단백질 말고도 unbound protein이 존재하기 때문에 브래드포드 값이 나올 수 있습니다.
만약에 형광단백질이 달린 님 타겟단백질이 binding buffer나 washing 과정에서 직접적으로 검출이 되었다면 두 가지 가능성이 있는데,
하나는 resin이 제 기능을 못하거나 (이 경우에는 맨 위에 쓴 것처럼 his가 달린 다른 positive를 좀 받아다가 실험해보면 됩니다)
아니면 님이 만든 버퍼 조성이 잘못되었거나 둘중 하나입니다.
20mM sodium phosphate / 300mM NaCl 은 binding에 전혀 문제없는 조성이고, 정상적인 6x HIS라면 binding과 washing에서의 이미다졸 농도도 지금 쓰고 계신게 문제가 없습니다.
버퍼 만드는게 실수가 있나 걱정되고 부담되시면 기본 버퍼를 그냥 PBS로 바꾸시고 imidazole을 10mM씩 차근차근 올려보면서 정제하면 될듯합니다.
soluble하지만 aggregator 형태로 존재하는 단백질이 종종 있습니다.
이런 경우 His-tag으로 정제가 안 되는데 그런 상황이 아닌지 의심되네요.
Size exclusion chromatography가 가능하다면 확인해볼 필요는 있을 것 같습니다.
이런 종류의 실험은 각 단계마다 SDS-PAGE로 목표단백질이 정제 단계마다 분리가 되는지 확인하는 것이 좋습니다.
그래야 어느 단계에서 단백질을 잃어버렸는지 알 수 있고 실험을 수정할 수 있습니다.