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BioLab 장재봉 교수
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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 RNA 추출이 되지 않는데 제 실험에 뭐가 문제인지 봐주시면 정말 감사하겠습니다..
알uiouio(대학생)  | 2022.11.18 11:26
안녕하세요. RNA 추출 관련해서 궁금한 점이 있어 댓글남깁니다.
먼저 두서없이 긴 질문 드린 점 죄송합니다.
현재 RNA 추출을 해야하는데, RNA 추출이 실험의 처음 단계이고 이걸 넘어가야 다음 단계를 넘어갈 수 있는데 몇 번을 해봐도 절대 나오지 않는 난황을 겪고 있지만, 실험실에 RNA 추출하시는 분이 현재는 계시지 않아 도움을 요청할 곳이 없어 너무 힘들어 도움 요청해봅니다..

제가 지금 stool suspension에서 RNA를 추출하고 있는데 몇 번을 해봐도 항상 RNA 추출이 안되더라구요..

Nanodrop 측정 결과 A260/A28은 3부근이 나오고, A260/A230은 0.19부근이 나옵니다.
또한 agarose gel로 측정했을 때도 밴드가 보이지 않습니다.
agarose gel의 경우, RNA가 600bp가 넘으면 agarose gel로도 확인이 가능하다고 하여 일반 DNA agarose gel 만드는 방식으로 만들었으며, loading은 RNA(측정결과 110 ng/uL) 1uL, 6x loading dye 1uL, DEPC treated water 1uL를 섞어 loading하였습니다.

Nanodrop 결과와 agarose gel 결과를 통해 RNA가 깨졌거나 아예 추출되지 않았다는 것을 알게 되었는데 실험 과정 중 어떤 부분이 문제일지 여쭙고 싶습니다.

먼저 사용하는 샘플인 stool suspension은 다른 연구실에서 받은 것으로, 10^6 pfu/mL의 농도를 가졌으며, 전처리 후 filter까지 내린 액체 상태의 샘플을 보낸 기준으로 3시간 후에 받아 바로 -80도에 aliquot하여 사용할 때마다 하나씩 꺼내서 사용합니다.

저희 연구실의 경우, DNA, protein, E. coil 등을 취급하며 공간이 넓지 않아 RNA 를 추출할 때는 클린벤치를 이용하였습니다.

먼저 실험하기 전, tip과 ep-tube, 핀셋은 auto clave로 가열멸균하여 RNA용으로 따로 만들었으며, 시약을 제외한 사용할 모든 기구들읕 70% 에탄올로 닦아준 후 클린벤치에 넣고 1시간동안 uv를 쬐어 소독을 시켜주었습니다.

그런 후 사용할 시약들은 에탄올로 소독하여 넣어준 후 실험동안에는 클린벤치를 절대 나가지 않았습니다.

또한 추출하는데 사용하는 제품은 Qiagen의 viral RNA mini kit입니다.
처음 제품을 받아서 프로토콜에 나온대로 310 ug의 carrier RNA에 AVE 버퍼(lysis용)를 310 uL를 넣어주어 냉동 시킨 후, 5.6 ug씩 aliqout한 것을 사용 전 용해시켜 AVL 버퍼 560 uL에 섞어준 후,
이 용액에서 560uL를 따 140uL의 stool suspension과 섞은 후 10분 간 반응시켜주었습니다.

그런 후 560 uL의 99% 에탄올을 섞어 볼텍싱 후 컬럼을 돌려 만든 (stool suspension+AVL+에탄올) 용액을 2번을 걸쳐 컬럼에서 걸러주었습니다.

그런 후, AW1 500 uL를 넣어 1분동안 6000rpm으로 버퍼를 걸러 주었고
다음으로는 AW2 500 uL를 넣어 13000 rpm으로 3분 간 걸러주었습니다.

마지막으로 kit에 있는 AVE 버퍼를 넣고 1분간 배양하여 용출해주었습니다.
또한 이 결과가 잘 나오지 않아 연구실에서 예전에 만들어 놓은 DEPC treated water를 용출 용액으로 사용하기도 하였습니다.

파이펫을 잡는 손은 최대한 샘플에 손을 닿지 않도록 주의하며 실험을 할 때는 꼭 마스크를 씁니다.

전반적인 제 실험과정은 이러한데 RNA 추출의 nanodrop 결과는 할 때마다 A260/280은 3부근이, A260/A230은 0.1~0.4부근이 나오는데 도대체 제 실험 과정에서 어떤 부분이 문제일까요..?
#추출
 
#RNA
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2022.11.18   

- 일반 전기영동에서 110ng loading해서는 잘 안보일 겁니다.

알uiouio  |  2022.11.18   
전기영동의 부분은 농도를 더 높여서 해봐야겠네요..! 감사합니다!
혹시 그럼 나노드랍의 결과가 좋지 않은데 RNA가 추출되기도 할까요??
대왕개구리SPEED  |  2022.11.18   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- nano drop결과도 무시 못하지만 분해된 상태 등 quality는 알수가 없습니다.

 

- 변성 전기영동이 가장 좋지만 일반 전기영동에서도 어느정도 확인은 가능하며 가능하다면 sample만이라도 변성시켜 전기영동하는 것도 좋습니다.

알uiouio  |  2022.11.18   
도움되는 좋은 조언 장말정말 감사드립니다!!
ㅅㄹㅇ  |  2022.11.21    

우선 그냥 RNA는 잘뽑히는게 맞는지 보려면

가지고 계신 세포샘플로 한번 RNA를 뽑아보시고

그건 잘나오고 진짜 샘플이 안나온다면

샘플이 RNase에 오염되어 안나오는것일 수도 있으니 확인해 보시기 바랍니다.

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