48Well, X40 

48-Well, X100(X40과 동일한 부분 확대)

안녕하세요 

어제도 셀 모양과 관련해서 글을 올렸는데 감사하게도 한분이 답변 해주셨지만, 

명쾌히 해결이 되지 않아서 다시 글을 올리게 되었습니다. 

우선 사진은 Passage 5인 휴벡입니다. *Passage 5-6까지만 사용합니다. 

subculture를 하면서 처음에는 매끈한 동그라미 모양이였지만, 점점 셀이 떼지지 않고 뗐을때 모양도 자글자글한 동그라미 모양으로 변하기 시작했습니다. passage 3인 셀도 마찬가지입니다 ㅠㅠ 

플라스크에서는 큰 차이를 보지 못하는데 반면 웰 플레이트에 시딩 한 이후 10h 뒤에 확인했을 때 자글자글한 동그라미 모양으로 아직 붙어있지 못한 셀들이 많았습니다.

또한, 셀 주변으로 일그러져있는 먼지 모양을 한 것들이 많이 생기기 시작했는데 확대를 했을 때 움직이는건 잘 모르겠어서 이게 컨탐인지 아니면 셀 상태가 좋지 않아서 이런건지 조언을 구하고자 다시 올리게 되었습니다. 

우선 HEPES로 Washing을 해준 다음 Trypsin edta 처리는 인큐베이터 안에서 3분으로 진행합니다 *떨어지지 않은게 많을 땐 4분까지도 합니다. (근데 이때 이미 셀이 자글자글한 동그라미 상태입니다) 

그런다음 전동파이펫으로 TNS를 넣고 5-6번 흘려서 모서리에 셀을 모으고 1000rpm 3min 센트리를 돌리는데 여기서 셀 다운이 한 80% 정도 되고 나머지 20%는 상층액에 둥둥 떠있습니다. 이게 셀 상태가 좋지 않다는 것을 의미한다고 알고 있는데 셀 관리도 36-48h 에 한번 프레쉬한 미디아로 바꿔가면서 키우는데 어느 스텝에서 셀이 상태가 안좋아지는 지 모르겠습니다.. 

셀은 항상 카운팅 후 50X10^4-80X10^4 175cm^2에 키우고 있고, 센트리 후 1000파이펫으로 1ml씩 넣어가면서 풀어주고 있습니다. 어제 답변으로는 블루팁에 의해 셀이 스트레스를 받을 수 있다고 해서 1ml은 파이펫으로 풀어주고 나머지 볼륨은 전동파이펫으로 살살 풀어줬습니다. 

인큐베이터 물은 항상 3차 증류수이며, 문을 열고 닫는 횟수는 좀 많은 편입니다. (세포를 다루는 실험실이라 실험실 인원 전원이 사용하고 있습니다) 제 셀의 경우 제 칸을 따로 사용중에 있고 셀도 최대한 안쪽에 넣어두고 있습니다. 최근에 다른 칸에서 곰팡이종류로 보이는(셀에 검정색 먼지?같은게 붙어있음) 컨탐이 일어나긴 했지만 제가 쓰는 두칸에서 같은 종류의 컨탐은 보이지 않았습니다. 실험할 때 알코올도 굉장히 많이 쓰고 실험전 uv도 30분에서 1시간 정도 켜두고 있습니다. 아 그리고 미디아 상태도 깨끗하고 보통 2-3일에 한번씩 다 써서 거의 새 상태입니다. 

정말정말 도움이 필요합니다 ㅠ 읽어주셔서 감사합니다!