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질문 western blot caspase-3 관련 질문
알대하권생(대학원생)  | 2022.10.31 18:04

웨린이가 웨스턴 고수님들께 여쭙고자 고민 끝에 질문 올리게 되었습니다.

혹시 Caspase-3 가 아주 잘 나오더라도 cleaved caspase-3 가 안나오는 경우가 있을까요??

Cell signaling 의 caspase-3 #9662 를 사용하여 cleaved form 과 동시에 확인하려고 하는데, proform 은 아주 확연하게 차이가 나는 반면 cleaved size는 아주아주 깨-끗 하게 나오는 상황입니다..

lysate 양도 늘려보고 1'Ab binding time 도 늘려보았는데 잘 안나오네요..

1'Ab 비율을 늘려보는 시도는 아직 해보지 않았지만 아주 깨끗하게 cleaved band 자체가 뜨지 않는 상황이라 의미가 있을 지 잘 모르겠습니다ㅜㅜ

웨린이를 도와주세요 고수님들

#Western blot
 
#cleaved Caspase-3
 
#band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알대하권생  |  2022.10.31   

현재 1:1000 비율로 실험은 진행 중에 있습니다

-_-  |  2022.10.31    

apoptosis가 안 일어나나 보죠 뭐...

알대하권생  |  2022.10.31   

ㅜㅜ 그렇다기엔 세포 몰폴로지가 동글동글하게 거의 떨어지기 직전이었고,

Bcl-2나 proCaspase-3 같은 경우에 경향성이 너무 뚜렷해서요

독성을 보이던 그룹에서 효과적으로 감소하는 것이 확인 되었습니다.

거의 밴드가 보이지 않을 정도로 감소하는 것이 확인되었고, 

housekeeping gene 뿐만아니라 모든 밴드의 형태가 아주 균일한 밴드로 확인이 되었습니다.

-_-  |  2022.11.01    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

IHC나 IF로 조직이나 세포 염색해도 안 나오나요? TUNEL이나 Hoechst염색하면 DNA가 조각조각나나요?

positive control(apoptosis-induced cell, H2O2나 기타 ROS 건드리는 약물)에서도 밴드가 아예 안 뜨나요?

항체가 뭔가 이상한 거 같은데 (+) ctrl band나 IHC, IF로 사진 한번 보시던지 해야겠는데요.

[질문글] [westernblot] Cleaved caspase-3 안티바디 디텍션 안되는 이유 > BRIC (ibric.org)

[질문글] caspase-3

위 질문글들도 보시고요. 딸려온 세컨더리가 맛이 간 경우도 있다네요.

대왕개구리안재진  |  2022.11.01   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

고민스럽겠네요... 저또한.... 어려웠던 실험으로 기억이 있네요... 

이게 나와야 다음 스텝 혹은 말이 맞아 떨어지는데... 

혹시 lysis를 RIPA로 했나요? 아니면 1x loading dye로 바로 샘플링을 하셨나요? 셀이죽어 나가니 바로 샘플링인 안했을것 같네요...

그렇다면 CHAPS buffer 로 lysis를 해보세요... 특히 cell signaling caspase 항체는 CHAPS와 궁합이 맞았던것으로... 실험이 안되면, 가끔은 루틴 실험에서 변형할 필요도 있습니다.

그리고 detection은 full form에 맞춰 expose 하지 마시고 작은 사이즈에 맞워 expose를 하시고요...

추가.. 인터넷에서 찾아봤습니다. 

https://media.cellsignal.com/pdf/9663.pdf

꾸룽이  |  2022.11.01    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

현재 Caspase 3 실험 계속 진행하고 있는 연구자입니다. 

제 경험상 Cleaved Caspase3의 경우 어떤 셀라인을 해도 잘 나오지 않았습니다. 그래서 지금까지 얻은 최적의 western condition 남기고 갑니다. 

일단 단백질 loading양은 40-50ug 으로 진행했습니다. 

Cleaved caspase3 CST # 9664 으로 진행했고 First 1:1000으로 24H, Second 1:2000 16H 진행했습니다. 이때 세포에 따라 다르긴 한데 5% BSA or Skim milk 사용했고 second는 다 skim milk 사용했습니다. 둘다 4도시 냉장고에서 진행했습니다. (그렇지 않을경우 굉장히 지저분하게 나와서 구분하기가 어려웠습니다.) 또한 제일 시그널을 잘 잡아낼수 있는 ECL solution사용했고 detection은 필름으로 현상했을때 시간이 꽤 걸렸습니다. 대략 10-30 분 정도 

도움이 되셨길 바랍니다. 

앞다리필1  |  2022.11.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

밴드가 한번에 딱딱 나오면 실험이 어렵지 않겠죠. ㅜㅜ

안나오는 안티바디는 뭘해도 안나오더라구요.

 

안티바디를 바꿔보세요

알대하권생  |  2022.11.07   

다들 정성스럽게 답변해주셔서 정말 감사드립니다

하나씩 차근히 읽어보고 실험에 참고해보겠습니다!!

저 또한 결과가 잘 나오게되면 선생님들처럼 다른 분들께 도움이 되었으면 좋겠습니다 ㅎㅎ..

안티바디를 추가 구매하는 것은 당장은 어려울 것 같고, 현재 expose 는 10분까지만 확인해봤었는데, 참고하여 더 길게도 해보는 것이 좋을 것 같습니다. 또 30 ug 까지만 한 well 에 걸어봤었는데 좀 더 과량으로 가능하다면 시도해봐야겠네요! 다들 감사해요!

+) 수정

lysate 양을 늘리고 노출 시간을 길게, 1' Ab를 1:500으로 가져갔더니 밴드를 얻을 수 있었습니다. 혹시 누군가 들어와서 실험과 관련하여 참고하실거라면 lysate 를 얻는 시간을 조절해보는 것도 좋을 것 같습니다.

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