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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 Cloning insert sequence에 의해서 plasmid prep 수율이 변할 수 있나요??
앞다리Anchovy(대학원생)  | 2022.10.26 20:09

 추워지는 날씨에도 연구하시느라 고생이 많으십니다. 


제가 최근에 parvovirus의 유전자를 cloning하고 있습니다. 
Elpis사의 TOPO cloning kit를 사용하고 있는데요 (pLPS vector) & promega pGEM-T-easy vector 둘다 시도 하고 있습니다.
 cloning 하고 transformation한 후에  colony PCR (primer는 insert 유전자 증폭한 것과 동일한 primer를 사용했습니다.) 하여 screening한 후에 picking하여 plasmid prep을 하면 이상하게 수율이 너무 안나오네요... 
동시에 진행한 다른 plasmid sample은 수율이 잘나오는데 말이죠.. pellet의 크기가 작지도 않았습니다..

vector에 cloning한 유전자에 의해서 plasmid의 수율이 달라질수가 있나요??.. 

긴 글 읽어주셔서 감사합니다. 도움 주시면 감사하겠습니다

#cloning
 
#plasmid prep
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2022.10.27   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
1. 수율이 어느정도 적은가요?

2. 수율이 적은 plasmid는 positive clone인가요?

insert에 의해 vector 복제에 문제가 생기는 경우가 있기는 한데 극히 낮은 확률이고 질문의 경우에 해당할지는 판단하기 힘듭니다.
앞다리Anchovy  |  2022.10.27   

답변감사드립니다! 
 1. 5 ml 배지에 picking 하고 30 ul에 elution 했을때 60 ng / ul 정도로 낮게나왔습니다. 

 2. colony PCR postivie이고, 전기영동 했을때 사이즈도 맞습니다. 

그러나 수율이 너무 낮아서... sequencing을 보내지는 않았습니다

대왕개구리SPEED  |  2022.10.27   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 수율이 낮은 positive clone을 host에 re-TF해서 plasmid를 추출해 보세요.

앞다리Anchovy  |  2022.10.27   

 조언 감사합니다 시도해보도록 하겠습니다~ 

 만약 re-TF한 후에 수율이 개선된다면 어떤점이 문제인지 알 수 있을까요 ?? 

대왕개구리SPEED  |  2022.10.27   

- 우선 re-TF한 것과 1차 selection하여 수율이 낮은 plasmid의 master plate가

있다면 해당 colony와 비교를 해보세요.

 

- master plate 균과 re-TF 균을 비교해서 결과를 봐야지 어느정도 추정이

가능할 것 같습니다.

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