정상적이지 않은 결과입니다.

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일반적으로 WST 실험과 같이 장기간 진행하는 실험의 경우에는 96 well 중에서 가장자리에 있는 well은 제외하고 안쪽에 있는 10*6에 해당하는 60well만 사용합니다.

가장자리에 있는 well에서 media가 증발하게 되면 측정하고자 하는  molecule의 농도가 증발한 media로 인해 농축된 값만큼 높게 측정됩니다.

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Cell을 깔아주는 습관이 중요합니다.

96 well에 cell seeding을 진행하는 과정에서 reservoir에 세포가 골고루 잘 퍼질 수 있도록 파이펫팅을 진행하고 가라앉기 전에 빠르게 다 깔아주어야 합니다. 말씀해주신 정도의 차이라면 애초에 well마다 깔린 세포의 수가 다를 가능성이 높고,

세포를 깔아준다음에 잘 퍼뜨려주려는 의도로 톡톡 쳐주게 되면 오히려 세포가 well의 중앙으로 모이며 불균일하게 깔리게 됩니다.

초보자 때에는 그냥 멀티로 세포를 넣어준다음에 안건드리고 그대로 두는게 가장 좋은 방법입니다.

cell seeding을 진행한 후 하루가 지나면 현미경으로 세포가 고루 잘 깔려 있는지 관찰하시면 됩니다.

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멀티가 고장나거나 멀티에 꽂아주는 tip을 실수로 헐겁게 꽂아서 WST가 절반만 들어가고 그러지 않는이상은 WST가 들어가는 양 자체의 variation으로 위와 같은 차이가 보이기는 쉽지 않습니다.

1. tip 한 번 쓰고 버릴것 (재사용 x) --> seeding 후 팁 확인 

2. 초보면 single pipette 으로 세포 깔면 더 잘나올 수 있음.

* 대부분 세포깔 때 뭉치거나 가라앉아서 동일량의 세포를 seeding 못함.

따라서 적당히 파이펫 에이드로 up down mix 하고 resorvoir 에 담아 파이펫팅 하고 넣을 것.

 현미경 확인 필수

3. seeding 막하고 CO2 incubation에 넣을 때 주의 (흔들리면 안됨)

4. plate reader 기기 읽는 순서대로 WST 시약 처리 할 것.

5. plate reader 기기에 들어가기 전 거품 확인 (거품 제거)

* 이렇게해도 문제있으면 pipette 보정 문제나 손 문제

계속하다보면 저절로 잘하게됩니다. 

- 세포 실험에서 질문과 같은 문제는 실험을 처음 시작하는 연구자에게 항상

발생합니다.

- 실험 재료를 균일하게 분주하는 것은 실험의 기초이지만 상당히 중요한

작업이며 용해된 시약보다 불용성의 미생물 균체, 동물세포 용액을 사용하는

것은 더욱 기술이 필요합니다.

- 질문의 문제점은 상당히 많은 부분에서 있을 가능성이 있기 때문에

실험자가 앞으로의 실험을 위해서라도 직접 가능성 있는 부분을 해결하는 수

밖에 었습니다.

- 여러번 실험해서 숙련도를 올리는 것이 가장 좋을 듯 합니다.