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질문 웨스턴 블롯 질문 드릴게요. 고수님들 도와주세요.
올챙이진vv(대학원생)  | 2022.10.14 21:36

웨스턴 질문좀 드리겠습니다. 

논문 작성에 앞서서 오래된 안티바디들 잘 작동하는지 확인 작업중에 있어요.

트렌스퍼 후에 폰슈로 단백질이 잘 내려온 것을 확인 했고 워시 30분 이상 한 후에 블락킹 1시간 정도 수행했습니다. 이후 4도씨에서 14시간 오버나잇 하며 1차를 붙였습니다.

다음날인 오늘 워시를 30분 이상 하고 2차를 붙이고 실온에서 2시간 가량 쉐이킹 후 워시를 다시 했습니다. 이후에 디텍팅을 했는데,, 사진처럼 화면이 아주 까맣게 나옵니다. 이경우 안티바디의 문제인건지,, 아니면 제가 1차를 너무 오래 붙여서 멤브레인이 타버린건지요ㅠㅜ,,, 또한 저렇게 말도안되는 점 하나만 찍혀 나온 경우는 1차가 잘 안붙었다는 뜻으로 해석해도 될까요? 아니면 안티바디에 문제가 생긴걸까요? 

upload_image

 

upload_image

질문을 정리하자면 다음과 같습니다.

 

1. 화면이 검게 나온경우 안티바디의 문제이다. 또는 시간이 너무 오래 지체되었다.(참고로 실험에 문제인가 하고 두번이나 실험했는데 똑같은 결과값을 얻었습니다.)

2. 실험실 선배 말로는 하우스 키핑젤 말고는 실온에 2시간 정도 1차를 붙이는건 안된다고 하는데,, 여기 고수님들은 대부분 1차를 실온에서 붙이는 것으로 보이네요. 하우스키핑젤이 아니라도 오버나잇하지않고 실온에서 1차를 붙여도 되는건지요.

3. 점으로 찍힌경우는 안티바디의 문제보단 제 실력의 문제로 1차가 잘 안붙어서 그렇다고 해석해도 될까요?

#웨스턴블롯
 
#멤브레인
 
#안티바디
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
ㅇㅇ  |  2022.10.14    

1. 화면이 검게 나온경우 안티바디의 문제이다. 또는 시간이 너무 오래 지체되었다.(참고로 실험에 문제인가 하고 두번이나 실험했는데 똑같은 결과값을 얻었습니다.)

->  ECL 감도를 낮춰보시거나 2차 항체를 더 적게 넣어서 희석해보셔야할거같습니다. 제가 보기에는 과도하게 노출된거 같습니다,

 

2. 실험실 선배 말로는 하우스 키핑젤 말고는 실온에 2시간 정도 1차를 붙이는건 안된다고 하는데,, 여기 고수님들은 대부분 1차를 실온에서 붙이는 것으로 보이네요. 하우스키핑젤이 아니라도 오버나잇하지않고 실온에서 1차를 붙여도 되는건지요.

-> 저는 진짜 급한 케이스 아니면 모든 항체를 오버나잇으로 4도씨에서 붙입니다.  housekeeping gene 도요.

3. 점으로 찍힌경우는 안티바디의 문제보단 제 실력의 문제로 1차가 잘 안붙어서 그렇다고 해석해도 될까요?

-> SDS page 자체의 문제일 수도 있고, transfer 과정의 문제일 수도 있습니다. 먼저 running 후 쿠마씨 염색을 통해 젤이 잘 내려왔는지 확인 하시고 transfer 후 Ponceau S staining 을 통해 transfer 가 잘 되었는지 확인해야할 것입니다.

대왕개구리SPEED  |  2022.10.14   
모든 항체를 붙일 때 O/N하지 않고 그런 규정은 없습니다.

냉장, 실온 모두 가능하고 연구원 별 선호하는 조건에서 실험하면됩니다.

실온에서 해도 무방하고 시간은 2시간이 아니라 조정을 해야 합니다.

개구리CD4+T  |  2022.10.15   

저도 윗분 말씀처럼 너무 과도하게 노출 된것 같다는 생각입니다. 그리고, 트렌스퍼가 제대로 되지 않은게 아닌가 합니다. 

하우스키핑 항체가 이미 검증이된 것 (감도가 좋아서 잘 나온다는) 이라면 굳이 4도 오버나잇 하지않고 실온에서 바인딩 시켜도 충분히 나옵니다.

 

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