[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
일루미나
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
전체보기 안전점검 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 453  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 2개의 PCR product를 ligation시키는 과정에서 enzyme site가 이상합니다.
알무농약감자(대학원생)  | 10.05 15:43

안녕하세요 cloning 실험을 진행중인 학생입니다.

현재 2개의 insert를 PCR을 통해 합성하여 ligation 시킨 후 vector에 넣어주기 위해 실험을 진행하고있습니다.

1번 PCR product 

(SacI) GAGCTC-----------

        -----------CGATCG (NheI)

 

2번 PCR product

(NheI) GCTAGC------------

         -----------CCCGGG (ApaI)

 

pirmer는 enzyme cutting이 잘 되도록 앞쪽에 AAA를 추가하여 제작하였고 PCR 후 enzyme cutting을 진행했습니다. (1H, 37 'C)

각각 enzyme cutting된 product는 gel에 loading하여 kit를 통해 extration하였고 takara ligation mix로 ligation을 진행했습니다. (1 H, 16 'C)

만들어진 ligation mix와 1번의 F primer, 2번의 R primer를 이용하여 PCR product를 제작하였고 size를 통해 ligation이 잘 되었는지 확인하였습니다. 

이후 1번과 2번이 ligation된 PCR product를 enzyme cutting, gel extration하여 준비했습니다.

준비한 insert는 SacI과 ApaI으로 cutting된 vector에 1:3, 1:5 비율로 ligation 시켰습니다.

transformation 후 colony PCR로 insert를 확인하고 mini prep하여 5개의 샘플을 sequencing 하였습니다.

 

sequencing 결과를 확인해 보니 GCTAGC로 있어야 할 NheI 부분이 5개 모두

GCTAGCTAGC 

CGATCGATCG

형태로 나오고 있습니다.

 

원인을 찾아보려고 노력하는 중인데 해결이 쉽지 않아 질문 드립니다.

이러한 문제가 생기는 원인이 뭘까요? 

어떤 자료들을 찾아봐야 원인을 알수있을지 너무 막막한 상태입니다.

도움이 될만한 키워드라도 생각이 나신다면 알려주시면 감사하겠습니다.

 

 

#cloning
 
#ligation
 
#enzyme
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.05 15:46  

- NheI 뒤에 오는 서열은 원래 어떤 서열인가요?

 

- ligation 했다면 PCR하지 않고 cloning해도 될것 같습니다만. 

알무농약감자  |  10.05 16:07  

NheI 뒤는 lusiferase gene 서열입니다.

ligation을 진행하고 PCR을 진행했던건 이 전에 같은 sample에서 XhoI enzyme site를 이용해 ligation을 할때 워낙 ligation이 잘 되지 않아 PCR로 증폭시켜보자는 생각으로 진행을했고 PCR product가 얻어져 enzyme site를 바꾼 이번에도 같은 방법으로 진행했습니다.

XhoI으로 ligation한 sample을 sequencing 한 결과도 지금과 같은 양상이 나와서 ligation 후 바로 사용하는 방법은 지금 다시 실험중입니다.

결과가 나올때까지 기다리고 있기가 답답해서 질문 드렸습니다.

원인은 모르겠지만 역시 PCR 과정에서 생긴 문제일까요?

대왕개구리SPEED  |  10.05 16:19  
1st PCR primer 문제로 보입니다.
답변하기
할인행사/신제품신기술 광고 검색광고
마크로텍 마크로텍
마크로텍 현미경 보유분 연말 특가판매~!! (12.30까지)
정코퍼레이션 정코퍼레이션
Cryogenic Label Printing System (5.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
Celvivo Demo모집! Request Form작성 후 신청시 80만원 상당 Celvivo Start K.. (12.28까지)
몰레큘러디바이시스코리아 몰레큘러디바이시스코리아
플레이트리더기 최대 40% 할인 (12.26까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
스트레스없이 3D 세포를 배양해보세요!!
닥터바이오 닥터바이오
고객감사 행사 EVENT!! DLP Bioprinter LUMEN X 행사 진행합니다! (12.31까지)
최근등록   더보기 >
MTT assay에서 IC50값 차이   12.05
FAM probe 형광 발현 문제,,,,   12.05
주화세포에 바이러스 접종시   12.05
Cell seeding시 media   12.05
Ribogreen assay 정확한 원리를 알고싶습니다.   12.05
stable cell line 만들때   12.05
skeletal muscle cross section area 측정방법   12.05
혈장 농축 방법 문의   12.05
mtDNA 추출   12.05
ppm을 mg/g dry weight로 변경하고자합니다   12.05
최근답변자 우수답변자
개구리Marine

알yjeu

개구리오이가싫어

개구리안녕난세포야

뒷다리실험은안될때가더많아

알청포도맛 망고

꽃개구리착한사람

알Steady

꽃개구리juno

꽃개구리TX

개구리cslee

개구리하늘을달려라

개구리미맹

꽃개구리juno

꽃개구리Jake

꽃개구리느림보

실험관련연재
세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고