실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
2개의 PCR product를 ligation시키는 과정에서 enzyme site가 이상합니다.
레벨1 무농약감자 (대학원생)
안녕하세요 cloning 실험을 진행중인 학생입니다.
현재 2개의 insert를 PCR을 통해 합성하여 ligation 시킨 후 vector에 넣어주기 위해 실험을 진행하고있습니다.
1번 PCR product
(SacI) GAGCTC-----------
-----------CGATCG (NheI)
2번 PCR product
(NheI) GCTAGC------------
-----------CCCGGG (ApaI)
pirmer는 enzyme cutting이 잘 되도록 앞쪽에 AAA를 추가하여 제작하였고 PCR 후 enzyme cutting을 진행했습니다. (1H, 37 'C)
각각 enzyme cutting된 product는 gel에 loading하여 kit를 통해 extration하였고 takara ligation mix로 ligation을 진행했습니다. (1 H, 16 'C)
만들어진 ligation mix와 1번의 F primer, 2번의 R primer를 이용하여 PCR product를 제작하였고 size를 통해 ligation이 잘 되었는지 확인하였습니다.
이후 1번과 2번이 ligation된 PCR product를 enzyme cutting, gel extration하여 준비했습니다.
준비한 insert는 SacI과 ApaI으로 cutting된 vector에 1:3, 1:5 비율로 ligation 시켰습니다.
transformation 후 colony PCR로 insert를 확인하고 mini prep하여 5개의 샘플을 sequencing 하였습니다.
sequencing 결과를 확인해 보니 GCTAGC로 있어야 할 NheI 부분이 5개 모두
GCTAGCTAGC
CGATCGATCG
형태로 나오고 있습니다.
원인을 찾아보려고 노력하는 중인데 해결이 쉽지 않아 질문 드립니다.
이러한 문제가 생기는 원인이 뭘까요?
어떤 자료들을 찾아봐야 원인을 알수있을지 너무 막막한 상태입니다.
도움이 될만한 키워드라도 생각이 나신다면 알려주시면 감사하겠습니다.
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