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지나가다가
(비회원)
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22.10.03 21:07
1. 식물 genomic DNA 추출시 분해 또는 조각 나는 원인은 다양합니다.
1) 식물 재료를 파쇄하는 동안 녹으면 DNase가 작용해서 분해가 일어날 수 있습니다.
- 따라서 충분한 액체질소를 이용하여 얼린 상태로 파쇄해야 합니다.
2) 얼려져 있는 파쇄된 가루는 반드시 CTAB buffer 와 닿으면서 녹아야 합니다.
- 그렇지 않으면 역시 분해가 일어납니다.
3) CTAB buffer 는 파쇄된 가루가 완전히 잘 녹을 수 있도록 충분한 양을 처리해야 합니다.
4) CTAB buffer 처리 이후 모든 과정에서 너무 심하게 vortexing, pipetting, 또는 흔들면 DNA가 조각나서 분해된 것처럼 될 수 있습니다.
2. 27번 샘플만 제외하면 모두 전기영동 사진의 제일 아랫쪽에 band가 보이고 이것 때문에 RNA가 오염되었다고 판단하신 것 같습니다.
- 다만, 이것이 RNA 일수도 있지만, 잘게 쪼개진 DNA 조각들일 수도 있습니다.
- CTAB buffer와 함께 충분한 RNaseA를 처리하셨고, 1번 설명처럼 분해되지 않게 조심해서 추출했다면 이런 band들은 잘 안 보일 것입니다.
제 생각에는 전기영동 사진을 보면 29번 샘플은 큰 크기의 DNA band가 존재하므로, 이후 PCR 이나 NGS 분석에 사용 가능할 것으로 생각됩니다.
일반적으로 column 방식 kit이 아닌 수작업 CTAB buffer 을 이용하여 식물 genomic DNA를 추출하면 29번 샘플 같이 뽑힙니다.
참고용 자료도 첨부했습니다.
좋은 실험 결과 얻으시길 기원합니다.
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레벨2
오르골
(대학원생)
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22.10.03 21:24
선생님, 조언해주셔서 정말 감사합니다!!!!!
혼자 밤새면서 하다보니,
샘플을 액체질소로 간 이후 버퍼에 넣기 전에 상온에 녹는 시간이 있었습니다.
그리고 제 시료가 다당류가 많아서 extraction 버퍼에 넣은 후에 뭉쳐있기때문에 겪하게 섞었던것도 원인인것같습니다.
답변주셔서 감사합니다.
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지나가다
(비회원)
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22.10.03 21:38
Extraction buffer를 넣은후 뭉쳐져 있는 것은 겪하게 흔들거나 vortexing해서 섞지 마시고, 1ml tip 이나 스파출라 같은 것을 사용해서 뭉게주시면 더 잘 섞입니다.
꼭 실험에 성공하시길 바랍니다.
그리고 buffer 넣기전에 상온에 두지 마시고 -20도 냉동실에 10~30분정도 넣어두면 액체질소도 날아가고 적당히 얼게되어 buffer를 처리하면 바로 녹게됩니다.
전기영동 결과를 보면 분해도 문제지만 추출 수율이 너무 낮습니다.
추출 방법을 변경하는 것이 좋을 듯 합니다.