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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 RNA quality check (nanodrop/gel electrophoresis) trouble shooting
알(대학원생)  | 09.28 21:06

안녕하세요.

 

RNA 추출 정제 퀄리티 분석에 질문이 있어 브릭 선배님들께 질문드립니다. 

 

저는 미세조류를 연구중인 박사과정생입니다. 

RNA 추출 및 qRT-PCR 분석을 주로 해오다, RNA-seq 분석을 위해 준비중입니다. 

세포를 대량 배양한 뒤 stress를 제공하고 전체 전사체 변화를 관찰하는 것을 목적으로 하고 있습니다. 

문제는 새로운 균주를 분리하였는데, 그 균주의 mRNA purity에 문제가 있는 것으로 보입니다. 

먼저 고농도의 mRNA을 얻고자 Trizol method를 이용하여 추출 후 전기영동하여 확인했습니다 (TBE, 100mV, 15min, 1% gel).

upload_image

 

1번 2번 3번 모두 서로 다른 균주입니다.

 

근데, 2번 샘플만 smear가 형성되며 밴드가 잘 확인되지 않습니다. 

Sample ID Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Factor
1 168.959 μg/ml 4.224 1.899 2.224 2.089 40.00
2 324.389 μg/ml 8.110 4.829 1.679 0.998 40.00
3 84.607 μg/ml 2.115 1.023 2.067 2.247 40.00

260/230 결과도 좋지 않게 확인됩니다. 농도는 좋은데, 농도가 왜 높게 나왔는지 원인 파악이 어렵습니다. 

 

trizol reagent 존재 하에 cool-homogenization 이후, chloroform을 처리하였고, 12000g 에서 15분 원심분리하였습니다. 1,3번 샘플들과 달리 2번에서만 보이는 특징은... 유일하게 노란색 상층액이 형성되었습니다. 이를 isopropanol 처리 후 pallet을 형성하였을때 불투명한 베이지색 pallet이 형성되었습니다. 

다행이 DW에는 잘 녹았지만, quality를 믿기 어려운 결과가 나와 재실험을 들어갔습니다. 

 

농도를 포기하고 purity를 높이기 위해 membrane column형식의 gene all kit (RiboEX )를 이용하여 RNA를 추출하였습니다. 

이때 탄수화물/당류의 오염을 고려하여 cell이 담긴 RiboEX 용액에 chloroform을 처리하는 것이 아니라, homogenization 이후 cell debris와 RiboEX 용액을 분리한 뒤 chloroform을 처리하였습니다. 이후 12000g에서 30분간 원심분리하여 최대한 깨끗한 상층을 얻고자 하였습니다. (원심분리 이후 상층액의 노란 정도는 줄었지만, 여전히 깨끗하진 않습니다)

 

Sample ID Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Factor
22-09-28-2 33.820 μg/ml 0.846 0.417 2.028 1.256 40.00
22-09-28-3 53.770 μg/ml 1.344 0.667 2.014 2.009 40.00
22-09-29-4 77.667 μg/ml 1.942 1.061 1.829 1.417 40.00

시료를 세 가지 다른 방식으로 추출하였습니다(필터 제거, debris 제거, 필터 및 debris 제거 등).  그 결과 3번 샘플이 260/280; 260/230 모두 괜찮게 나와 기대를 갖고 전기영동을 내려보았습니다. (TBE, 100mV, 12min, 1% gel)

upload_image

 야속하게 18S, 28S 밴드가 보이지 않습니다.

 

또 특징 중에 하나가, 이 샘플의 경우 trizol 및 RiboEX method 모두 가장 높은 peak가 260nm가 아닌 270nm에 가깝게 나타났습니다. 이러한 경우 오염에 의해 RNA-seq 분석이 어려운 상태인지 선배님들의 견해가 궁금합니다. 

또, RNA 전기영동시 rRNA 밴드가 형태가 끈적한 물질에 의해 smear처럼 형성하는 것인지, 혹은 실제로 RNA가 다 분해된 것인지 의견을 여쭈어 보고 싶습니다. 

 

브릭에서 올라온 해결 방안들을 보면서 여러가지 method를 실험해보았지만, 명확한 해결 방안을 찾지 못했습니다. 경험 많으신 선배님들의 많은 조언 부탁드립니다. 

 

감사합니다. 

#RNA purification
 
#purity
 
#quality
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.28 22:45  
분해 보다 추출이 안된것으로 보입니다.

RNA 추출이 gDNA 보다 쉽습니다.

완전한 lysis 및 불순물 변성 단계만 잘되면 순도와 농도 모두 잘 나옵니다.

단순하게 산성 페놀 방법으로 추출하면 모든 조직, 세포에서 RNA 추출이 가능합니다.
알  |  09.29 12:39  

SPEED님 안녕하세요. 

 

답변 감사드립니다.

 

질문이 있습니다. 만약 RNA가 뽑힌 것이 아니라면, nanodrop에서 확인된 260nm 값과 전기영동에서의  smear가 RNA가 아닌 다른 핵산류(DNA)인 것으로 생각해야 할까요? 

대왕개구리SPEED  |  09.29 12:53  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- DNA, RNA 모두 260에서 측정되고 일반 전기영동에서도 둘다 보입니다.

 

- 100% RNA가 추출 안된것이 아니라 수율이 낮다는 뜻입니다.

 

- 추출 자체가 정상적으로 되지 않고 있는 것은 분명합니다.

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