- 그럴 가능성은 없습니다.
- 어느정도 줄었나요?
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 10:30
네 기존의 size가 88kDa정도인데
70정도로 줄었습니다..
- WB에서 70kDa single band로 나왔나요?
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 10:47
아뇨 투밴드로 나왔습니다.
원래 size인 88kDa에는 band가 연하게 나오고 70kDa에는 아주 진하게 나왔습니다.
target이 processing된 form이 존재하지는 않나요?
Ab가 poly인가요?
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 10:54
target이 processing된 form이 존재하지는 않나요?
-어떤 의미인가요??
Ab는 monoclonal 입니다..
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 11:58
식사하고오느라 답변이 늦었네요
cell lysate는
NP40 buffer에 dye+b-mer이 들어간 시료입니다.
- cell lysate 만든 후 바로 WB했나요 보관 후 사용했나요?
사용하신 항체랑 타겟단백질 및 샘플 정보도 알려주시겠어요?
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 12:12
lysate는 만든후 바로 gel loading해서 사용했습니다.
Target단백질 은 Fibroblast activation protein이구요
Ab는 santacruz사의 sc-100528제품을 사용하여 WB진행하였습니다.
샘플은 cell을 NP40 buffer에 깨서 정량후 dye+b-mer넣어준뒤 15min boiling했습니다.
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 12:18
항체 data sheet를 봐도 뭐가문젠지를 모르겠네요... ㅜㅜㅜㅜㅜㅜㅜ
- target이 88kDa 나오는 것이 확실한가요?
- 이전 실험에서 동일 시료로 88이 나온것을 확인한 적이있나요?
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 12:23
네.. 이전실험에서도 확인했습니다
그리고 이번에도 88kDa에서도 연하게 밴드가 보입니다
- Data sheet에 88Kda라고 나오고 WB결과는 100kda이상에서 나옵니다.
- 다른 회사 Ab 결과를 봐도 FAPa 88kDa는 안보입니다.
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 12:39
100kDa이상은 나온적이없고
100kDa 보다 조금아래에 나옵니다.
논문 data를봐도 100kDa보다 조금 아래에 나오는 Data는 많이봤습니다.
- 현재 data sheet를 보면 100이상에서 나옵니다.
- 다른 회사 Ab는 없나요?
- 한가지 예로 아래와 같은 결과가 있습니다.
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 12:56
네 santa제품 외엔 없습니다...
- 88이 나온것은 질문자가 직접한 것이고 언제 실험한 결과인가요?
- 사견으로 저의 편견이지는 모르겠지만 90년대 부터 WB를 했지만 해당
회사제품을 사용하지 않는 편인데 현재의 현상을 해결하기 위해서는 다른
회사 Ab와 비교를 해보는 것이 좋지 않을까 보입니다
이런 상황인것 같네요...
제 생각에는 내 샘플이 무조건 맞다 라고 했을때 원하는 사이즈에서 밴드가 안나온다면 항체를 바꿔보는 것 밖에 없습니다.
아니면 Positive control을 걸어봐야 겠죠. Scbt에서 걸었다는 셀 라인을 같이 걸어 보는게 정확한데... 셀이 없다면 항체를 바꿔보는게 빠른 해결이 될수 있습니다.
원하는 사이즈에서 진하게 밴드를 본적은 있나요?
한가지더 말하면 저도 그 회사의 제품중 유명회사에 납품되는 같은 클론의 mAb를 제외하고는 구입하지 않습니다
특히 폴리항체는 더더욱 신중히 구매할필요가 있네요
실패본적도 몇번 있어서요
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 13:44
답변감사드립니다...
결국 항체를 바꾸는거외에 저의 프로토콜엔 문제가없는거겠죠..?
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 13:44
진하게 본적은 있습니다...
근데 밴드의 진하기가 좀 꾸준하진 않아요
질문에 따른 답변으로는 바꿔볼수 있는건 바꿔보는것도 방법입니다.
현재 질문자가 B-MeOH에 의한 영향을 고민한다면 DTT로 바꿔서 진행해보는것도 방법일수 있습니다.
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 14:12
답변감사합니다...
하지만
항체던.. DTT던 가격이 비싸서...
좀더 방법을 찾아봐야할거같습니다. 감사합니다
찾아보니 인트론에서 dtt 샘플버퍼 10ml에 3만원이네요
찾아보시면 더 저렴한 premade 제품이 있을것 같네요
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레벨2
오우
(대학원생)
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22.09.28 14:33
답변감사합니다
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레벨5
안녕난세포야
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22.10.02 12:48
ph변화떄문일수도 있을것같다는생각이드네요