[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
써모피셔사이언티픽
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
전체보기 안전점검 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 927  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 b-mercapto 가 protein cleavage 할수있나요?
올챙이오우(대학원생)  | 09.28 10:23

b-mer은 polymer 의 s-s bonds를 끊는 것으로 알고있습니다. 

제 WB실험중 단백질의 band의 size가 원하는 size보다좀더 낮게 나왔습니다. 

(glycosylation을 고려해도 훨씬 낮게나왔습니다.) 

단백질 4차구조에서 disulfide 를 끊어 monomer상태의 단백질을 b-mer가 더 cleavage해서 size가 낮게나온걸까요...?

처리 농도는 회사 protocol대로 처리하였습니다

#western blot
 
#WB
 
#IB
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.28 10:25  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 그럴 가능성은 없습니다.

 

- 어느정도 줄었나요?

올챙이오우  |  09.28 10:30  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

네 기존의 size가 88kDa정도인데 

70정도로 줄었습니다..

대왕개구리SPEED  |  09.28 10:42  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

-  WB에서 70kDa single band로 나왔나요?

올챙이오우  |  09.28 10:47  

아뇨 투밴드로 나왔습니다.

원래 size인 88kDa에는 band가 연하게 나오고 70kDa에는 아주 진하게 나왔습니다.

대왕개구리SPEED  |  09.28 10:51  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
target이 processing된 form이 존재하지는 않나요?

Ab가 poly인가요?
올챙이오우  |  09.28 10:54  

target이 processing된 form이 존재하지는 않나요?

-어떤 의미인가요??

 

Ab는 monoclonal 입니다..

대왕개구리SPEED  |  09.28 11:05  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
cell lysate가 시료인가요?
올챙이오우  |  09.28 11:58  

식사하고오느라 답변이 늦었네요 

 

cell lysate는 

NP40 buffer에 dye+b-mer이 들어간 시료입니다. 

대왕개구리SPEED  |  09.28 12:08  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- cell lysate 만든 후 바로 WB했나요 보관 후 사용했나요?

대왕개구리안재진  |  09.28 12:09  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
사용하신 항체랑 타겟단백질 및 샘플 정보도 알려주시겠어요?
올챙이오우  |  09.28 12:12  

lysate는 만든후 바로 gel loading해서 사용했습니다.

 

Target단백질 은 Fibroblast activation protein이구요 

Ab는 santacruz사의 sc-100528제품을 사용하여 WB진행하였습니다. 

샘플은 cell을 NP40 buffer에 깨서 정량후 dye+b-mer넣어준뒤 15min boiling했습니다. 

대왕개구리SPEED  |  09.28 12:16  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- data sheet를 확인해 보세요.

올챙이오우  |  09.28 12:18  

항체 data sheet를 봐도 뭐가문젠지를 모르겠네요... ㅜㅜㅜㅜㅜㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  09.28 12:22  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- target이 88kDa 나오는 것이 확실한가요?

 

- 이전 실험에서 동일 시료로 88이 나온것을 확인한 적이있나요?

올챙이오우  |  09.28 12:23  

네.. 이전실험에서도 확인했습니다

그리고 이번에도 88kDa에서도 연하게 밴드가 보입니다

대왕개구리SPEED  |  09.28 12:29  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- Data sheet에 88Kda라고 나오고 WB결과는 100kda이상에서 나옵니다.

 

- 다른 회사 Ab 결과를 봐도 FAPa 88kDa는 안보입니다.

올챙이오우  |  09.28 12:39  

100kDa이상은 나온적이없고

100kDa 보다 조금아래에 나옵니다. 

논문 data를봐도 100kDa보다 조금 아래에 나오는 Data는 많이봤습니다. 

 

대왕개구리SPEED  |  09.28 12:51  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 현재 data sheet를 보면 100이상에서 나옵니다.

 

- 다른 회사 Ab는 없나요?

 

- 한가지 예로 아래와 같은 결과가 있습니다.

 

Lane 1: Human U87MG cell lysates; Lane 2: Human Siha cell lysates; Lane 3: Human Hela cell lysates; Lane 4: Human A549 cell lysates probed with FAPA Polyclonal Antibody, Unconjugated (bs-5758R) at 1:1000 dilution and 4˚C overnight incubation. Followed by conjugated secondary antibody incubation at 1:20000 for 60 min at 37˚C.

올챙이오우  |  09.28 12:56  

네 santa제품 외엔 없습니다...

대왕개구리SPEED  |  09.28 13:02  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 88이 나온것은 질문자가 직접한 것이고 언제 실험한 결과인가요?

 

- 사견으로 저의 편견이지는 모르겠지만 90년대 부터 WB를 했지만 해당

회사제품을 사용하지 않는 편인데 현재의 현상을 해결하기 위해서는 다른

회사 Ab와 비교를 해보는 것이 좋지 않을까 보입니다

대왕개구리안재진  |  09.28 13:05  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

이런 상황인것 같네요... 

제 생각에는 내 샘플이 무조건 맞다 라고 했을때 원하는 사이즈에서 밴드가 안나온다면 항체를 바꿔보는 것 밖에 없습니다. 

아니면 Positive control을 걸어봐야 겠죠. Scbt에서 걸었다는 셀 라인을 같이 걸어 보는게 정확한데... 셀이 없다면 항체를 바꿔보는게 빠른 해결이 될수 있습니다.

원하는 사이즈에서 진하게 밴드를 본적은 있나요?

대왕개구리안재진  |  09.28 13:17  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
한가지더 말하면 저도 그 회사의 제품중 유명회사에 납품되는 같은 클론의 mAb를 제외하고는 구입하지 않습니다
특히 폴리항체는 더더욱 신중히 구매할필요가 있네요
실패본적도 몇번 있어서요
올챙이오우  |  09.28 13:44  

답변감사드립니다... 

결국 항체를 바꾸는거외에 저의 프로토콜엔 문제가없는거겠죠..?

올챙이오우  |  09.28 13:44  

진하게 본적은 있습니다...

근데 밴드의 진하기가 좀 꾸준하진 않아요

대왕개구리안재진  |  09.28 14:03  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

질문에 따른 답변으로는 바꿔볼수 있는건 바꿔보는것도 방법입니다.

현재 질문자가 B-MeOH에 의한 영향을 고민한다면 DTT로 바꿔서 진행해보는것도 방법일수 있습니다.

올챙이오우  |  09.28 14:12  

답변감사합니다...

하지만 

항체던.. DTT던 가격이 비싸서... 

좀더 방법을 찾아봐야할거같습니다. 감사합니다 

대왕개구리안재진  |  09.28 14:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
찾아보니 인트론에서 dtt 샘플버퍼 10ml에 3만원이네요
찾아보시면 더 저렴한 premade 제품이 있을것 같네요
올챙이오우  |  09.28 14:33  

답변감사합니다

개구리안녕난세포야  |  10.02 12:48  

ph변화떄문일수도 있을것같다는생각이드네요

답변하기
할인행사/신제품신기술 광고 검색광고
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
스트레스없이 3D 세포를 배양해보세요!!
닥터바이오 닥터바이오
고객감사 행사 EVENT!! DLP Bioprinter LUMEN X 행사 진행합니다! (12.31까지)
바이오닉스 바이오닉스
[TECAN No.1 한국공식대리점] TECAN Automation / Liquid handler / Mic.. (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
더욱 짧고 specific하게 주문 제작 가능한 BiosearchTech의 MGB Probes, LNA ol..
몰레큘러디바이시스코리아 몰레큘러디바이시스코리아
플레이트리더기 최대 40% 할인 (12.26까지)
사이젠 사이젠
[Cyagen 슈퍼할인] KO마우스 무료 증정/녹아웃 카탈로그 모델 $2950 이상 할인 (12.31까지)
최근등록   더보기 >
MTT assay에서 IC50값 차이   12.05
FAM probe 형광 발현 문제,,,,   12.05
주화세포에 바이러스 접종시   12.05
Cell seeding시 media   12.05
Ribogreen assay 정확한 원리를 알고싶습니다.   12.05
stable cell line 만들때   12.05
skeletal muscle cross section area 측정방법   12.05
혈장 농축 방법 문의   12.05
mtDNA 추출   12.05
ppm을 mg/g dry weight로 변경하고자합니다   12.05
최근답변자 우수답변자
개구리Marine

알yjeu

개구리오이가싫어

개구리안녕난세포야

뒷다리실험은안될때가더많아

알청포도맛 망고

꽃개구리착한사람

알Steady

꽃개구리bio

개구리식스센스

개구리냥냥아빠

개구리닥눈삼

개구리A'ANE

개구리안녕난세포야

대왕개구리강시

대왕개구리안재진

실험관련연재
세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
필코리아테크놀로지 광고