저 중에서 굳이 골라야하면 4요
2-propanol 넣고 인버팅 제대로 안하면 침전이 제대로 안될거예요
마우스 폐 조직 몇 그람으로 추출 진행하시는지요?
그리고, Trizol을 이용한 방법이라 생각이 되는데, Trizol로 제대로 lysis를 시킨 후 한번 진행해 보실길 바랍니다.
Trizol 방법이라는 가정하에, 투명한 층을 따실때 너무 모든 것을 따려고 하지마시고 generous하게 좀 남겨두시길 바랍니다. 그 이유는 Trizol 추출 방법을 검색해 보시면 나옵니다.
화이팅 하세요!
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마카롱_
(대학원생)
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22.09.27 10:03
Chloroform 넣고 centrifuge 돌린 다음에 생기는 층이
aqueous phase가 RNA이고 그 다음 층이 DNA인 것으로 알고 있는데, 바짝 따면 RNA가 그냥 안나올 수도 있는 건가요?
바짝 따도 purity가 떨어지는 것이지 pellet이 아예 안보일 수가 있는 건가요?
안녕하세요.
1. lung을 homogenizer로 가는 과정이 너무 세게 진행되면 안될까요?
--> 열만 잘 관리 된다면 쎄게 해도 됩니다.
homogenize할때 아이스박스 위에서 차가운 트리졸로 하시죠?
저의 경우 조직은 주로 액체질소, 막자사발, 트리졸로 했습니다.
2. chloroform을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요?
--> 볼텍스 추천드립니다. 충분히 섞여야 합니다.
3. chloroform을 넣고 centrifuge를 돌린 다음, 상층액을 따는 과정에서 너무 바짝 따는 것이 문제일까요?
--> 능력대로 따면 됩니다. 저는 조금 남깁니다.
4. isopropanol을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요?
--> 저는 젠틀리 인버트 10회가 가장 좋았습니다.
5. mouse lung에서 RNA extraction하는 것이 어려운 것인가요?
--> 어떻게 조직을 잘 깨냐 그리고 RNAase를 관리하냐에따라 쉽기도 어렵기도 합니다. 귀찮아서 그렇지 난이도는 높지가 않다고 생각됩니다.
1. 에탄올 위싱 후 펠렛은 흰색으로 보이다가 마르면 안보입니다.
2. 조직과 트리졸 비율 그리고 조직의 양을 확인이 필요해보입니다.
3. 정량값과 순도만 맞다면 눈에 안보이더라도 큰 문제는 없어보입니다.
참고로 RNA가 눈에 안보이고 RNA양이 적은것같으며 PCR시 GAPDH도 안나온다라고 하면 또다른 이야기입니다.
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마카롱_
(대학원생)
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22.09.27 14:01
Isopropanol 넣고 centrifuge 돌린 후 pellet을 관찰하면 pellet 자체가 보이지 않습니다.
intestine 조직에서 똑같이 진행했을 경우, lung에서만 RNA extraction이 안되어서요..ㅠ
pellet이 관찰되지 않은 샘플들은 Nanodrop찍어도 농도가 나오지도 않고, purity값도 현저히 떨어집니다..
제대로 섞지 않아서 pellet이 관찰되지 않은 걸까요?ㅠㅠ
Lung 조직이 intestine 이나 다른 기타 조직에 비해 성겨서(구멍이 뽕뽕이니까요) 조직 양이 더 필요할 수도 있어요 더 넣어보세요
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마카롱_
(대학원생)
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22.09.27 16:26
1. trizol 1ml 첨가 후 homogenizer
2. chloroform 200ul 넣은 후, 3min incubation at room temperature
3. 15,000rpm, 4도, 15min centrifuge
4. 새 e-tube에 상층액 (RNA) 따기
5. isopropanol 500ul 넣은 후, 10min incubation at room temerature
6. 15,000rpm, 4도 10min centrifuge
7. pellet 확인 후, 상층액 버리고 75% EtOH 1ml 추가
<<7번 과정하기 전 centrifuge를 돌리고 pellet이 관찰되어야 하는데 이때 보이지 않습니다.>>
8. 11,000rpm, 4도 5min centrifuge (washing)
9. 상층액 버리고 pellet dry
10. pellet이 마르면 DEPC water 추가한 뒤, 10min heat block
여기까지 제 프로토콜입니다.
- step1에서 완전히 파쇄되는지는 어떻게 확인하나요?
- step2에서 vortex 10sec x 3times.
- step5에서 충분히 inverting한 후 -20도 30분.
or
- step1.에서 65도, 30분 후 ice 10min. -> step2로 진행.
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마카롱_
(대학원생)
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22.09.28 10:17
- 1번에서 갈고 나서 조직 덩어리(?)가 안보이는 것으로 파쇄되었다고 판단합니다.
- 2번에서 vortex해보도록 하겠습니다..!
- 1번에서 65도라는 것은 어떤 것을 말하는 것인지 알 수 있을까요..ㅠ
- 파쇄 후 heating -> cooling - Chloroform
Purify가 떨어지는게 아니라 degradation시키기 때문에 그 층을 딸때 매우 주의 하셔야합니다
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왕초보석사생
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22.09.30 13:58
저 같은 경우에는 Trizol을 넣어 주고 상온에서 5분 정도 두냐 안두냐의 차이가 생각보다 RNA 수율 차이가 엄청 크더라구요.
https://takara.co.kr/file/manual/pdf/9108_9109_e.v1904Da.pdf
제품명은 다르지만 takara에서 나온 trizol 제품 프로토콜인데 한번 확인해보시면 도움될 것 같습니다.
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마카롱_
(대학원생)
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22.10.11 16:43
chloroform 넣고 vortexing한 다음 진행해보아도 비특이적으로 어떤 sample에서는 pellet이 뜨고, 어떤 sample에서는 pellet이 안보이네요..ㅠㅠ
상층액 딸 때에도 엄청 바짝 따지 않았는데,,
혹시 상층액 따는 과정을 제외하고서는 RNA가 degradation될 수 있어 조심해야되는 과정이 또 있을까요...