[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
일루미나
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioLab 신동혁 교수
전체보기 안전점검 LABox
 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
조회 580  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 RNA extraction
알마카롱_(대학원생)  | 09.26 23:22

안녕하세요. 석사 과정 진행 중인 대학원생입니다.

실험실에서 mouse lung을 채취하여 RNA extraction을 진행하는데 문제가 있어 문의를 남기게 되었습니다.

몇 달째 항상 RNA extraction할 때마다 pellet이 비특이적으로 관찰되지 않습니다.

군차이로 인해 pellet이 안보이는 것도 아니고, 어떤 샘플에서는 나타나고 어떤 샘플에서는 나타나지 않고 너무 비특이적입니다.

실험실에 있는 protocol대로 RNA extraction을 진행하였고, 실험방에 있는 모든 선생님들이 그 protocol대로 RNA를 뽑습니다. 따라서, protocol에는 문제가 없습니다.

시약 문제라기에는 실험방에 있는 모두가 같은 시약을 쓰고, aliquot해서 사용하는 것이라면 다 새로 aliquot하여 사용했습니다. 따라서, 시약에는 문제가 없는 것 같습니다.

여러 방안에서 많이 생각해보다가 RNA extraction하는 과정 중에 pellet이 안보이는 이유가 다음과 같은 이유들로 인해 문제가 될 수도 있는지 궁금한 것들을 나열해 보았습니다.

1. lung을 homogenizer로 가는 과정이 너무 세게 진행되면 안될까요?

2. chloroform을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요?

3. chloroform을 넣고 centrifuge를 돌린 다음, 상층액을 따는 과정에서 너무 바짝 따는 것이 문제일까요?

4. isopropanol을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요?

5. mouse lung에서 RNA extraction하는 것이 어려운 것인가요?

열심히 searching했는 데도 불구하고 왜 비특이적으로 나타나지 않는 것인지 알 수가 없어서 이곳에 문의를 남깁니다..

선생님들께서도 이러한 문제를 겪으신 적이 있는지 궁금하고, 어떻게 해결하셨는지 궁금합니다..

혹은 선생님들께서 RNA extraction 과정 중 주의하는 점들이 있다면 그것을 알려주신다면 감사하겠습니다.. 과정마다 제가 잘 주의하여 했는지 돌이켜 보고 싶습니다.

#pellet
 
#RNA
 
#Lung
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
ㅇㅇ  |  09.26 23:45   

저 중에서 굳이 골라야하면 4요

2-propanol  넣고 인버팅 제대로 안하면 침전이 제대로 안될거예요

앞다리CD4+T  |  09.27 06:17  

마우스 폐 조직 몇 그람으로 추출 진행하시는지요?

그리고, Trizol을 이용한 방법이라 생각이 되는데, Trizol로 제대로 lysis를 시킨 후 한번 진행해 보실길 바랍니다.

Trizol 방법이라는 가정하에, 투명한 층을 따실때 너무 모든 것을 따려고 하지마시고 generous하게 좀 남겨두시길 바랍니다. 그 이유는 Trizol 추출 방법을 검색해 보시면 나옵니다.

화이팅 하세요!

 

알마카롱_  |  09.27 10:03  

Chloroform 넣고 centrifuge 돌린 다음에 생기는 층이

aqueous phase가 RNA이고 그 다음 층이 DNA인 것으로 알고 있는데, 바짝 따면 RNA가 그냥 안나올 수도 있는 건가요?

바짝 따도 purity가 떨어지는 것이지 pellet이 아예 안보일 수가 있는 건가요?

개구리현직백수  |  09.27 13:17  

안녕하세요. 

1. lung을 homogenizer로 가는 과정이 너무 세게 진행되면 안될까요?

--> 열만 잘 관리 된다면 쎄게 해도 됩니다. 

      homogenize할때 아이스박스 위에서 차가운 트리졸로 하시죠?  

      저의 경우 조직은 주로 액체질소, 막자사발, 트리졸로 했습니다. 

2. chloroform을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요?

--> 볼텍스 추천드립니다. 충분히 섞여야 합니다. 

3. chloroform을 넣고 centrifuge를 돌린 다음, 상층액을 따는 과정에서 너무 바짝 따는 것이 문제일까요?

--> 능력대로 따면 됩니다. 저는 조금 남깁니다.

4. isopropanol을 넣고 inverting을 하는 과정에서 세게 혹은 약하게 하는 것이 문제가 될까요?

--> 저는 젠틀리 인버트 10회가 가장 좋았습니다. 

5. mouse lung에서 RNA extraction하는 것이 어려운 것인가요?

--> 어떻게 조직을 잘 깨냐 그리고 RNAase를 관리하냐에따라 쉽기도 어렵기도 합니다. 귀찮아서 그렇지 난이도는 높지가 않다고 생각됩니다. 

1. 에탄올 위싱 후 펠렛은 흰색으로 보이다가 마르면 안보입니다. 

2. 조직과 트리졸 비율 그리고 조직의 양을 확인이 필요해보입니다. 

3. 정량값과 순도만 맞다면 눈에 안보이더라도 큰 문제는 없어보입니다.

참고로 RNA가 눈에 안보이고 RNA양이 적은것같으며 PCR시 GAPDH도 안나온다라고 하면 또다른 이야기입니다.  

알마카롱_  |  09.27 14:01  

Isopropanol 넣고 centrifuge 돌린 후 pellet을 관찰하면 pellet 자체가 보이지 않습니다.

intestine 조직에서 똑같이 진행했을 경우, lung에서만 RNA extraction이 안되어서요..ㅠ

pellet이 관찰되지 않은 샘플들은 Nanodrop찍어도 농도가 나오지도 않고, purity값도 현저히 떨어집니다..

제대로 섞지 않아서 pellet이 관찰되지 않은 걸까요?ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  09.27 14:22  

- protocol이 어떻게 되나요?

dd  |  09.27 15:30   

Lung 조직이 intestine 이나 다른 기타 조직에 비해 성겨서(구멍이 뽕뽕이니까요) 조직 양이 더 필요할 수도 있어요 더 넣어보세요

알마카롱_  |  09.27 16:26  

1. trizol 1ml 첨가 후 homogenizer

2. chloroform 200ul 넣은 후, 3min incubation at room temperature

3. 15,000rpm, 4도, 15min centrifuge

4. 새 e-tube에 상층액 (RNA) 따기

5. isopropanol 500ul 넣은 후, 10min incubation at room temerature

6. 15,000rpm, 4도 10min centrifuge

7. pellet 확인 후, 상층액 버리고 75% EtOH 1ml 추가

<<7번 과정하기 전 centrifuge를 돌리고 pellet이 관찰되어야 하는데 이때 보이지 않습니다.>>

8. 11,000rpm, 4도 5min centrifuge (washing)

9. 상층액 버리고 pellet dry

10. pellet이 마르면 DEPC water 추가한 뒤, 10min heat block

여기까지 제 프로토콜입니다. 

대왕개구리SPEED  |  09.27 19:07  

- step1에서 완전히 파쇄되는지는 어떻게 확인하나요?

 

- step2에서 vortex 10sec x 3times.

 

- step5에서 충분히 inverting한 후 -20도 30분.

or

- step1.에서 65도, 30분 후 ice 10min. -> step2로 진행.

알마카롱_  |  09.28 10:17  

- 1번에서 갈고 나서 조직 덩어리(?)가 안보이는 것으로 파쇄되었다고 판단합니다.

 

- 2번에서 vortex해보도록 하겠습니다..!

 

- 1번에서 65도라는 것은 어떤 것을 말하는 것인지 알 수 있을까요..ㅠ

대왕개구리SPEED  |  09.28 10:27  

- 파쇄 후 heating -> cooling - Chloroform

앞다리CD4+T  |  09.29 04:48  

Purify가 떨어지는게 아니라 degradation시키기 때문에 그 층을 딸때 매우 주의 하셔야합니다

알왕초보석사생  |  09.30 13:58  

저 같은 경우에는 Trizol을 넣어 주고 상온에서 5분 정도 두냐 안두냐의 차이가 생각보다 RNA 수율 차이가 엄청 크더라구요.

 

https://takara.co.kr/file/manual/pdf/9108_9109_e.v1904Da.pdf

 

제품명은 다르지만 takara에서 나온 trizol 제품 프로토콜인데 한번 확인해보시면 도움될 것 같습니다.

알마카롱_  |  10.11 16:43  

chloroform 넣고 vortexing한 다음 진행해보아도 비특이적으로 어떤 sample에서는 pellet이 뜨고, 어떤 sample에서는 pellet이 안보이네요..ㅠㅠ

상층액 딸 때에도 엄청 바짝 따지 않았는데,,

혹시 상층액 따는 과정을 제외하고서는 RNA가 degradation될 수 있어 조심해야되는 과정이 또 있을까요...

답변하기
할인행사/신제품신기술 광고 검색광고
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
다시 돌아온 패널 프로모션! 모든 고객 패널 2+1 이벤트!! (12.28까지)
바이오닉스 바이오닉스
[TECAN No.1 한국공식대리점] TECAN Automation / Liquid handler / Mic.. (12.31까지)
사이젠 사이젠
[Cyagen 슈퍼할인] KO마우스 무료 증정/녹아웃 카탈로그 모델 $2950 이상 할인 (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
스트레스없이 3D 세포를 배양해보세요!!
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
재현성 있는 (q)PCR을 위해 필요한 분주 자동화 기기, BMS의 Myra
나노팬텍 나노팬텍
3차원 세포배양용기를 사용하여 기존 2차원 세포배양의 한계를 극복해보세요! (11.30까지)
최근등록   더보기 >
western할때 transfer 이 두판밖에 안됩니다 ㅠ   11.28
항체 species reactivity   11.28
Seed culture와 final concentration에 관한 기초질문   11.28
우유 속 미생물   11.28
프랙탈을 이용한 인체에 가해지는 무릎하중 구하기   11.27
세균배지가 녹는 이유 좀 알려주세요ㅜ   11.27
PEO가 약물방출에 미치는 영향   11.27
미토콘드리아로의 전위 관련 해석이 안됩니다ㅠ   11.27
안녕하세요 Lowry method의 보완법을 고안하던 중 질문 드립니다.   11.27
SK-BR-3 cell 을 긴급히 구하고 있습니다.   11.26
최근답변자 우수답변자
꽃개구리착한사람

알KEEPCALM

대왕개구리SPEED

개구리AstV

알Hms

알나르

대왕개구리강시

알마포구주민

꽃개구리발그런

개구리Lucid

개구리Daegu*

개구리flu...

개구리무광

대왕개구리SPEED

꽃개구리착한사람

개구리달려라~

실험관련연재
세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
진스크립트 광고