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BioLab 박소정 교수
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 protein extraction 후 protein 농도에 관한 고민이 있습니다.
알맞는길을고르지(대학생)  | 09.23 14:25

안녕하세요, 매번 검색만 하다가 처음 질문 남겨봅니다. 

protein extraction을 하고 정량을 했는데 protein 농도가 터무니없이 적게, 거의 안 넣었다고 봐도 될 정도로 나왔습니다. 샘플마다 값도 너무 튀고요.. 동일한 조건으로 이전에 실험했을 땐 이정도로 적게 나오진 않았어서 매우 당황스럽습니다.. 제가 복기 해봤을 때 기존과 크게 다른 점이 없어서 너무 답답합니다. 앞으로 이 분야를 더 배우고 싶은데, 단백질 추출도 못하면 무슨 실험을 진행할 수 있겠나 싶어서 막막합니다.

제가 아직 학부생이라 부족한 점이 많습니다... 제가 한 실험 과정과 정량 후 결과값은 아래에 첨부해두었습니다. 잘 부탁드립니다.


lung cancer cell 4*10^5으로 6well에 seeding >> 18h 후 80%정도 찬 것을 확인 후, 시료처리 >> 24h 후 protein extraction

<extraction>

1. media suction 후 well당 cold DPBS 1mL로 washing >> suction후 cold DPBS를 well당 1mL씩 넣고 스크래퍼로 긁어준 뒤 따서 e-tube로. 3000rpm, 5min, 4℃ centrifuge

; 여기까지 진행했을 때 처리한 시료 농도가 높았던 샘플 하나(B3라고 하겠습니다)가 pellet이 안 보였습니다.

 

2. 상층액 suction 후 RIPA solution 넣고 강하게 피펫팅 >> 강하게 볼텍싱 >> ice에 꽂아놓고 20min incubating(5min 간격으로 강하게 볼텍싱 해줬습니다.)

; RIPA+P.I.+PMSF를 1:0.01:0.001로 섞어서 RIPA solution을 만들었고, 위에서 언급한 B3는 20uL로, B3를 제외한 나머지 샘플들은 80uL로 pellet을 풀어줬습니다. 

피펫팅은 100uL짜리 피펫으로 거품이 날 정도로 세게 여러번(제 체감상으로는 한 40번정도 피펫팅한 것 같아요)했습니다.

 

3. 15000rpm, 20min, 4℃ centrifuge >> 상층액만 따서 새 e-tube에 넣기

; centri 끝나고 나니까 첫 centrifuge 사용때보다는 줄었지만 pellet이 보였고, B3에서도 아주 조그만 pellet이 보였습니다. 

상층액은 80uL로 푼 샘플들은 75uL, 20uL로 푼 샘플은 15uL정도 딸 수 있었습니다.

 

4. 정량

1, 2, 3, 4, 5는 standard A1~3, B1~3은 sample입니다.(A1, B1은 CTR)

  1 2 3 4 5 A1 A2 A3 B1 B2 B3
DDW 18 14 10 6 2 18 18 18 18 18 18
RIPA 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0
sample 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2
BSA 0 4 8 12 16 0 0 0 0 0 0
DC A 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
DC B 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800

단위 : uL

표와 같이 조합 후 볼텍싱해주고 상온에서 15min incubating >> 96well에 well당 200uL씩 넣고 750nm 흡광도 촬영

 

5. 계산

표 윗줄은 최근 실험 결과, 표 아랫줄은 이전 실험 결과입니다.

R^2   A1(CTR) A2 A3 B1(CTR) B2 B3
0.9906 1uL당 농도 0.579531 0.265105 0.295931 1.424168 1.07275 0.172626
0.9902 1uL당 농도 1.005952 0.809524 0.815476 2.029762 1.863095 1.369048

현재 이런 상황입니다. 저희 랩실 사람들이 80uL로 풀었을 땐 대부분 람다당 농도가 1은 넘습니다.

저의 고민은

1. 왜 람다당 농도가 거의 0에 수렴하는가?

2. 왜 람다당 농도가 샘플마다 이렇게까지 차이가 나는가?(추출 전 육안으로 cell상태 확인했을 때 confluency랑 비례하지도 않음..)

이렇게 두 가지 입니다. 제발 문제점을 파악해서 잘 해결될 수 있으면 좋겠습니다..

#protein extraction
 
#단백질 정량
 
#단백질 농도
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.23 15:26  

- 원심분리는 1K 이하로 해보세요.

 

- 1, 2, 3의 cell 수는 대충 어느정도 차이가 있나요?

알맞는길을고르지  |  09.26 00:26  
- 답변 감사합니다. 제가 답변 확인이 늦었네요.. 네 알겠습니다. 한 번 해보겠습니다.

- 다 같은 셀이고 약 종류가 2개, 친 약의 농도가 3가지였는데요, 육안으로 봤을 때 A1, 2, 3은 100 85 75 B1, 2, 3은 100 85 50 정도 돼보였습니다.
학생  |  09.28 13:41   

실험 과정에 문제는 없어 보입니다. 

 

개인적인 의견으로 단백질 정량값 결과에서 차이가 큰 것은 파이펫팅 문제라고 

생각됩니다. 실험자님의 부주의가 아닌 파이펫 자체가 오래됬을수도 있어요. 

문제가 어떤 원인으로부터 발생했는지 확인하기는 힘들지만 protein lysate를 10배 희석 시킨 다음 20ul씩 용액이랑 섞은 후 정량을 다시 해보시면 안정적인 결과를 얻으실 수 있을 것으로 생각됩니다. 

 

1. protein sample 5ul를 RIPA 45ul랑 섞어주세요. 

2. 20ul의 sample을 이용해서 실험을 진행하시고 결과를 비교해보세요. 

알맞는길을고르지  |  09.29 15:01  
감사합니다. 과정에는 문제가 없다니 그나마 마음이 좀 놓이네요..
알려주신 방법대로 진행해 볼 수 있다면 해보겠습니다. 감사합니다.
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