Ni-NTA agarose (Qiagen)으로 protein purification하고 있는 대학원생입니다.

실험실에서 처음으로 재조합 후 단백질 발현을 하고 있는데 궁금한 점이 있어 올립니다.

<protocol>

1. 200mL LB broth (AP100) OD600: 0.5-0.7 incubation

2. 0.1mM IPTG, 30℃, 150rpm, 6h induction

3. 원심분리 및 supernatant 제거 (-80℃ 보관)

4. 20mL lysis buffer (50mM NaH2PO4. 300mM NaCl, 10mM imidazole)

5. Lysozyme 1mg/mL incubate on ice for 30min

6. Sonication (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 30회)

7. 원심분리, supernatant 및 pellet 보관

8. Ni-NTA slurry 1mL 원심분리 및 supernatant 제거

9. 2mL lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl) mix (inverting)

10. 원심분리 및 supernatant 제거

11. 20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker)

12. lysate-Ni-NTA micture column으로 옮긴 후 bottom cap 제거하여 flow-thrugh 수집

13. 2.5mL washing buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole)로 2번 진행 및 수집

14. 0.5mL Elution buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole)로 4번 진행 및 수집

15. BCA assay, SDS-PAGE

<질문>

1) 50mL culture로 sonicaiton (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 20회) 조건으로 충분히 파쇄되고 약간 투명해지는게 확인됐습니다. 하지만 200mL culture는 기존 조건으로는 덜 투명해져서 sonication 횟수를 30회로 늘렸는데 더 좋은 방법이 있을까요? 횟수가 늘어나면 좋지 않다고 들어서요.. (현미경으로 관찰하면서 cell 파쇄됐는지 추가로 확인하고 있습니다.)

2) SDS-PAGE 결과, Elution 쪽에 목표 단백질인 약 30kDa 외에도 여러 band가 떴습니다. 이에 교수님은 Ni-NTA에 protein을 붙이는 과정에서 잘못된거 아니냐고 하셨는데 '20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker)' 반응을 더 늘려야 할까요?

3) 약간 바보같은 질문일 수 있는데 혹시 protein genE size가 855bp인데 kDa으로 환산하면 30kDa이 맞을까요?.. 사이트랑 기존 계산법으로는 30kDa으로 나오는데 교수님은 70kDa이라고 하셔서요..