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PD-10을 이용한 buffer exchange 관련
레벨1 감자랑나랑 (대학생)
안녕하세요. PD-10을 이용한 buffer exchange 관련해서 질문이 있습니다. 제가 protein을 주로 다루지 않고 화학분야라 처음해봐서 어려움이 많네요 ㅠㅠ
제가 할 것은 His tag protein의 조성이 실험에 영향을 주어 Buffer exchange를 하려고 합니다. 이때, PD-10 column이 제 실험에 적합할 것 같아 사용하려고 합니다.
- Storage condition : 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 125 Mm imidazole, 50% Glycerol (v/v)
- Exchange 후 condition : PBS
질문 :
1) Glycerol 50% (v/v)이 viscosity하여 column하는데에 영향을 줄 것 같아 dilutio해서 진행하려고 하는데 어느 정도 %로 할지 궁금합니다. 서치해보니 5~10% glycerol 정도는 PD-10 으로 가능할 것 같은데 기준 같은 것이 있을까요? 잘 분리되는지 여부는 small scale로 test를 해봐야 아는 걸까요?
2) Gravity protocol 에서 elution 단계에서 3.5 mL를 받는다고 적혀있는데 보통 하나의 test tube에 전부 받는지, 아니면 조금씩 (약 0.5 mL) 씩 나눠 받는지 궁금합니다. 또한, 3.5 mL 를 받고 나서 추가적으로 더 elution buffer를 넣어서 collection하진 않을까요? Protein이 다 나오지 않았을 수 도 있으니까요.
프로토콜 첨부하겠습니다. 도움주시면 감사하겠습니다. ㅠㅠ
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