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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 Ni-NTA regeneration 이해가 안 가네요..
올챙이암세포(대학원생)  | 09.21 09:18

안녕하세요?

나름 Histag purification 고인물이라고 자처했는데,,, 아주 기초적인 부분에서 질문이 있어 남겨봅니다.

제 질문은 아래와 같습니다.

 

Elution 후 Ni와 결합한 Imidazole을 어떻게 제거하는가? PBS만으로 왜 제거 되는가?

 

저는 보통 Elution 후에 아예 Ni를 없애버리고, recharging 하는 방식을 썼었는데,

이게 Elution 후에 그냥 PBS로 washing만 하고 (Ni 유지), 다시 써도 되더라구요;;;

그렇다면 PBS washing이 Ni와 결합한 Imidazole을 고효율로 씻어내렸다는건데…

그게 가능한가요? Imidazole과 competition하는 내 histagged 단백질은, PBS washing에 끄떡없는데 말이죠?

혹시 소중한 지식 있으시면 나눔 부탁드립니다.

 

*참고) resin capacity는 거의 60 mg 이었고, 그거 다 잡고 PBS washing 후 flowthrough 30 mg정도 또 잡음. 그 외에도 엄청 많이 사용하는데 계속 됨;;

#histag
 
#Ni-NTA
 
#purification
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.21 09:42  

- recharge한 후 다시 사용가능 합니다.

gloomydayzz@snu.ac.kr  |  09.21 10:57   

ㄴ 당연히 recharge 후에 가능한데, 왜 PBS washing만으로 regeneration이 되냐는 질문이었습니다

대왕개구리SPEED  |  09.21 11:03  
당연히 안됩니다.

알호다구아  |  09.21 12:22  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
약하게 붙기 때문에 PBS나 물로 washing만 해도 떨어지는 거죠.
Kd: ~His tag: ~uM, imidazole: ~mM
대왕개구리SPEED  |  09.21 12:38  

- 그렇게 쉽게 떨어지면 sample loading 시 1X His가 있는 비특이 단백질은

washing 단계에서 모두 제거가 쉽게 되어야 하는데 정제를 해보면 그렇지가

않습니다.

올챙이암세포  |  09.21 12:48  

호다구아님 감사합니다. Imidazole과 histag의 Ni binding affinity가 1000배 차이면 이해가 가네요. 근데, 그렇게 약한 binding의 imidazole이 competition으로 histag~Ni를 elution하는게 의외네요. 쪽수가 많아서 그럴까요?

Speed님, 저도 님과 똑같이 생각했는데, 실제로 되니깐 질문을 하는겁니다. 저도 한 7년정도 histag 정제를 했고, 무조건 stripping buffer 쓴 후, Ni recharging 해서 썼는데, 실제로 PBS만 써도 이게 regeneration되는게 신기해서 질문드리는겁니다. 제 본문을 참고해주세요 ㅎ resin capacity가 남아돌아서 생기는 현상도 아닙니다

올챙이암세포  |  09.21 13:09  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

호다구아님 답변에 힌트를 얻어 검색한 결과, research gate에 비슷한 문답이 있기에 가져와봅니다. (아래 사이트, Dominique Liger 답변참고)

https://www.researchgate.net/post/How-imidazole-being-removed-from-Ni-NTA-resin-using-equilibrium-buffer

호다구아님 말씀대로 imidazole~Ni 는 ~mM Kd, histag~Ni 는 ~uM Kd (세 분자와 Ni 하나가 결합하므로) 이며, 따라서 imidazole은 그냥 binding buffer만 처리해도 분리된다고 하네요

다른 분들을 위해 추가 답변 남겨놓습니다.

dd  |  09.22 13:09   

오 저도 정제만 한 6년했는데 새로운 사실이네요!!!

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