- induction +/ - 전기영동은 없나요?
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레벨2
agaz
(대학생)
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22.09.20 12:07
Induction +/-에서의 차이도 확인하였습니다.
- 자료가 제한적이어서 판단하기 힘듭니다만 indicution이 안된거 안닌가요?
- PPT를 어떤 처리 후 정제했나요?
- FT는 전기영동 결과가 없나요?
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레벨2
agaz
(대학생)
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22.09.20 12:46
1.Induction은 다른 Data와 비교한 결과 됐다고 생각합니다.! 그리고 만약 안됐다고 한다면 Transformation하지 않은 (-)con BL21(DE3)와 비교했을 때도 65kDa부근에서도 보였습니다.
2,3 PPT와 FT가 무엇의 약자인지 찾질 못했습니다. protein purification과, Induction유무에 대한 질문이 맞을까요?
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1234
(비회원)
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22.09.20 13:02
loading 시 2-ME 넣으셨나요 혹시? disulfide bond로 된 dimer 형태인가 싶어서요
- ppt = precipitation = insoluble fraction.
- 발현 단백질이 물에 녹지 않을 텐데 어떤 방법을 진행한 후 정제를 했나요?
- FT = flow through
시료를 resin에 붙인 후 안붙은 fraction 자료가 전기영동에 없습니다.
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레벨2
agaz
(대학생)
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22.09.20 13:31
1234-
네 b-Mer가 포함된 protein staining Dye를 넣고 95도씨에서 10분 boiling 후 loading하였습니다. 또한 발현된 protein은 Cys기를 총 2개 가지고 있습니다.
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레벨2
agaz
(대학생)
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22.09.20 13:38
speed-
1.lysis후 supernatant를 취하고 남은 pellet을 lysis buffer(PBS or other buffer)로 풀어준 후 다른 protein과 동일하게 boiling후 loading하였습니다.
2. Figure에 Binding buffer라고 적혀있는 부분이 binding되지 않은 fraction이며 Equilibration buffer로 내린 protein입니다.
- resin에 cell lysis 후 insoluble fraction을 boiling한 후 붙였다는 얘기 인가요?
- 변성한 후 붙이지 않았나요?
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레벨2
agaz
(대학생)
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22.09.20 14:03
His-tag purfication과 SDS-PAGE는 각각 다르게 진행하였으며,
Insoluble fraction(pellet)은 His tag purification을 진행하지 않았고, supernatant만 purification을 진행하였습니다.
또한, 제가 말씀드린 Boiling은 purification이 다 끝난 후 loading전에 Disulfide bond를 끊어주어 linear한 형태로 만들기 위해 한 것입니다.
- A는 insoluble하게 발현되었는데 A+B는 soluble하게 발현되었나요?
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agaz
(대학생)
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22.09.20 17:25
본문에 내용을 잘못 적었네요, 죄송합니다.A라는 eukaryotic protein 을 soluble하게 발현하였으며, B와 ligation하여 발현 시 insoluble해진 것 같다는 예상입니다! 정제 후 Bradford 진행 시 125ug/mL정도의 농도가 나옵니다.
- 내용이 바뀌는 것 같은데 A = soluble, A+B = insoluble이라면 "Insoluble
fraction(pellet)은 His tag purification을 진행하지 않았고, supernatant만
purification을 진행하였습니다. " 라고 했는데 A+B를 sup으로 정제하면
안되는거 아닌가요?