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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
조회 358  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 RT PCR Rna추출 과정에서 pellet이 보이지 않습니다..
알규규궁(대학생)  | 09.18 21:22

안녕하세요. 현재 6well에 Raw cell을 seeding해 RT PCR을 진행하고 있는 학생입니다. 
밑에 첨부한 사진과 같은 프로토콜로 진행하고 있는데, 세포가 많은 상태에서 진행함에도 불구하고
Rna isolation 과정에서 pellet이 거의 보이지 않으며, nano drop 260/280결과, Nucleic acid 농도도 굉장히 낮아
cDNA 합성을 진행할 수가 없는 상태입니다 ㅜㅜ. 

upload_image
(나노드롭 결과를 따로 정리한 파일입니다. ) 

rna 추출을 8번 이상 진행했는데도, 제대로 결과가 나온적은 한 번밖에 없습니다. ㅠㅠ

제가 RNA 추출 과정에서 세포를 죽이는 것 같은데, 아무리 생각해도 뭐가 문젠지 모르겠어 질문을 올리게 되었습니다. 
모든 실험은 클린벤치에서 진행하고 있고, 지금까지 에탄올을 첨가할 때 조심스럽게 넣지 않았는데 그것이 문제인건지..?
아니면 트라이졸 피펫팅 과정에서 20번을 넘게 하기 때문에 세포가 죽어버리는건지 ..? 모르겠습니다 ㅠㅠ 
미리 답변 감사드립니다! 

 

#RTPCR
 
#RNA isolation
 
#rna extraction
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.18 22:51  
6번에서 충분히 혼합하나요?
알규규궁  |  09.18 23:08  

안녕하세요ㅠㅠ!

혼합이 피펫팅이나 볼텍싱을 말씀하시는 걸까요?? 따로 섞어주진 않고 isopropanol을 넣은 후 10분 기다리고 있습니다! ㅠㅠ 

대왕개구리SPEED  |  09.18 23:11  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
inverting으로 잘 혼합해야 침전 효율이 올라갑니다.
알규규궁  |  09.18 23:15  

답변 감사드립니다! ㅠㅠ

제가 inverting이라는 단어가 생소해서 그런데, EP tube 밑부분을 잡고 천천히 뒤집었다 돌렸다 하는 과정을 말씀하시는게 맞을까요?? 

ㅇㅇ  |  09.18 23:24   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

inverting 이 그거 맞습니다 저는 ep tube 윗부분 잡고 5-6번 뒤집어줍니다.

 이소프로판올 침전 스텝은 inverting 후 -20도에서 오버나잇으로도 진행하니 수율이 떨어지면 그렇게도 해보세용

대왕개구리SPEED  |  09.19 00:36  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
inverting, vortexing은 용도가 조금다르고 tube를 뒤집어서 혼합하는것이 inverting입니다.

iPA는 동량 혼합으로 침전력이 강하기 때문에 실온 또는 -20도 30분이면 충분할 겁니다.
알규규궁  |  09.19 01:31  
정말 감사드립니다 !! 알려주신대로 진행해보도록하겠습니다 :)
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