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아무것도 안치는 샘플(none) 하나, 모든 형광 처리하는 샘플 (positive) 하나 + 형광 1개당 샘플 한개 (compensation용.. 이때 사용하는 형광은 모두 같은 antigen으로 통일 예- cd4-fitc cd4-pe cd4-pecy7...)
보통 이렇게 만듭니다.
compensation 잡기전 none과 pisitive 샘플로 FSC SSC 및 각 형광 의 voltage강도를 조절해주고요 (none에선 singlet 이 기울기 1로 나오게, lymphocyte가 fsc 50-100 사이에 오게... positive에선 형광의 negative plot이 10^2 부근에, positive plot이 10^4 부근에 오도록)
그 다음 각 형광 1개만 처리한 샘플을 이용해 각 형광간의 간섭을 최소화하는 compensation을 합니다. (PE만 염색한 샘플에서는 PE만 신호가 잡혀야지 FITC가 잡히면 안되겠죠? 그런데 autofluorence라던지 conjugation된 dye라서 형광이 샌다던지 하는 이유로 다른 형광이 잡히게 됩니다. 이런걸 시스템상으로 보정해주는거에요)
BMDC 실험하실때 GMCSF를 쓰시나요 Flt3L를 쓰시나요? 저도 궁금한게 있는데 질문드려도 될까요
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레벨5
ʕ•ﻌ•ʔ뀨
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22.09.13 10:01
학부생이 혼자서 진행하시는걸까요?
FACS라는건 혼자하기 힘든 영역이라............................
(혼자라면.......화이팅..........................)
윗분말씀대로,
compensation란 보정을 뜻합니다.
싱글인 하나의 형광을 할때는 필요없지만, 두개이상의 형광을 할때는 필요합니다.
형광끼리의 간섭이(겹치지) 않도록 하기 위함이죠.
compensation을 위한 cell의 well은 필요없습니다.
cell counting 하시고 필요양만큼 각 tube에 넣으시고 남은 cell로 진행하시면되요. (저는 보통 남은 cell을 mix 해서 사용했습니다.)
compensation으로 PE와 PE-cy7 각각 하나의 tube를 만들어주면되요.
negative control로 아무것도 처리하지않은 tube로 만들어주시면되요
나머지 샘플은 모두 PE와 PE-cy7 넣어주시고 (또는 원하는 조건에 맞게)
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레벨1
호구마
(대학생)
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22.09.13 12:59
답변해주셔서 감사합니다. 덕분에 compensation이 뭔지 이해했습니다. 두분 알려주신대로 실험 design 해보겠습니다 :)
아이이이잉님! 저희 랩실 protocol에선 GMCSF를 사용합니다. 제가 도움이 될지는 잘 모르겠지만 쪽지 주시면 답변하겠습니다