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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 4096  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 플라스미드가 사라져요
봄봄봄  |  2009.03.28 01:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
제가 pUC vector에 프로모터를 연결하고
이걸 DH5a에 TF해서
글리세롤 스탁한후 -20도에 보관했었거든요
오래되지도 않았어요 그렇게 한지 고작 보름...
근데 처음 얼렸는것을 풀때 (ampicilin LB에 접종할때)는
분명 그 플라스미드가 있었거든요 (prep하고 나서)
그런데 이걸 다시 했을땐
플라스미드 농도가 상당히 줄어들었드라구요
(pUC는 high copy라서 band가 되게 진한데 말이죠)
그리고 오늘 좀전에 prep하여
band를 보니 아예 없어졌드라구요
ㅠ ㅠ
이거 도대체 어떻게 된일이죠?
접종시 전부 LB배지에 ampiciline분명히 넣었는데...
대장균이 amp내성이 생겨서 플라스미드를 뱉어낸건가요?
아니면 prep과정 중 플라스미드가 파괴되서 그런걸까요?
아~자꾸 이상한 일이 생기니 점점 클로닝에 대한 자신감이 없어지네요 ㅠ
앗 그리구요
아가로스 겔에 DNA걸때요
로딩 다이 안섞어주면 (혹은 로딩 다이가 잘못만들어져 기능이 안되는거라면)
EtBr에서 밴드 관찰 안되나요?
요전번엔 아가로스겔에 전기영동 한거
EtBR에 염색해서 보니 사이즈 마커는 정상적으로 나왔는데
(그옆에 걸어준 )PCR한게 안나왔더라구요 (처음 하는것도 아니고 계속 해왔던건데요)
근데 로딩하는 홈안에 밴드가 보이는것 같던데...(즉 밴드가 제 위치에 안내려오고
겔의 (-)전극 쪽 홈에서 보인다는거죠)
이런일도 생기나요?
#플라스미드
 
#전기영동
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리엘피스  |  2009.03.28   
뭔가 다른데 원인이 있지 않나 합니다.
Stock을 제대로 해놓았다면 10년이 지나도 plasmid는 정상적으로 나와야 합니다.
사실 cloning에 관련된 문제는 아주 사소한 일에서 발생을 하지만 그 원인을 찾기가 쉽질 않습니다. 그래서 잘 될때는 아주 잘 되다가도 문제가 발생하면 계속 발행하는 것이 cloning인데 이때는 좀 쉬면서 다른 일을 하던가 아니면 다른 사람의 손을 빌려보는 것도 한 방법일 겁니다.

Loading dye가 없으면 gel loading자체가 어렵습니다. Loading dye라고 해봐야 Tris buffer에 dye와 glycerol (침강제)이 들어 있는 것이 전부입니다. EtBr염색과는 무관한 것이며, 제 생각에는 아마 DNA가 없거나 깨졌기 때문인 것 같습니다.

예전에 미리 뽑아놓았던 DNA를 이용하여 테스트를 해보세요.
꽃개구리TX  |  2009.03.28   
-20도에 보관하셨다고 하셨는데, 사용한 Freezer가 일반적으로 가정에서 사용하는 거라면
-20도를 지속적으로 유지되지 않고 소량씩 녹았다 얼렸다를 반복합니다. 안쪽이 얼음이 얼어 붙지 않도록 하기 위해서죠..실험용으로 쓰는 냉동고 (-20)를 보면, 냉동고 안쪽이 얼음으로 가득 얼어 있습니다. 다음번에는 -80도 defreezer에 보관하세요...



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