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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 면역침전 stst3 dimer 형성
알달봉달봉(대학원생)  | 08.19 16:23

안녕하세요. 석사 3학기차 IP 실험 중입니다. 실험진행 중 궁금한 점이 여러 개 생겨 여쭤봅니다! 

1. 약물처리 시 stat3의 dimer 형성 억제 확인 실험을 진행하려고 하는데 WB 시 젤(gel)에 SDS가 포함되지 않는 것이 좋은건가요...?

2. NON-REDUCING SAMPLE BUFFER은 phospho form 확인 시 진행하면 좋다고 들었는데 제가 보는 Marker는 total STAT3입니다. (CELLSIGNALING #9139)

저의 경우에는 Loading dye에 2-mercaptoethanol 제외하고 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue and 0.125 M Tris HCl(pH 6.8) 이 조성으로 만들었습니다. 

3. 또한 Input에 대한 개념을 아직 이해못했습니다.. input은 ip가 되지 않은 sample(lysate)을 같이 wb으로 넣어주는건가요...? 아님 dimer 실험에는 input이 필요없는건가요?

ip관련해서 작은 팁이 있으시다면 부탁드리겠습니다! 

감사합니다. 

1. SK-hep1 cells were plated in a 90mm dish (4.09x105 cell/well) and treated with drug 

2. The cells were washed with ice-cold PBS and lysed in 1× lysis buffer for 1h on ice followed by centrifugation at 13,000rpm for 15min.

3. The protein concentration was determined by using the Bradford protein assay.

4. Cell lysates (200μg) were subjected to immunoprecipitation by shaking the primary STAT3 antibody and protein A/G agarose bead(sc-2003) suspension at 4°C for overnight.

antibody 1:100

agarose beads: 50 uL, total volume (lysates+beads+ddw) 450 uL (ddw로 total volume 맞추는지?)

5. After centrifugation at 2,500rpm for 5min

6. Immunoprecipitation beads were collected by pouring the supernatant and washed with cell lysis buffer. (500μL) and centrifugation at 2,500rpm for 5min.

Repeat 3 times

7. The immunoprecipitation beads were then mixed with 20μl of 2× SDS Loading sample buffer and boiled for 5minat 95°C and centrifugation at 5,000rpm for 1min.

8. Supernatant (20μl) from each sample was collected by centrifugation and loaded on SDS-polyacrylamide gel.

 

#면역침전
 
#ip
 
#Western blot
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