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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western transfer가 잘 안되는 거 같습니다.
앞다리oneday(대학원생)  | 08.18 16:07

지금까지 50kDa 이하의 안티만 붙여서 거의 성공하였는데

이번에 60~70kDa대와 80~130kDa대 안티를 붙이게 되었습니다.

80~130kDa 안티를 붙일려고 gel 조성은 8%로 하였고 단백질 크기가 너무 크면 트랜스퍼가 잘 되지 않는다고 하여서 콜드룸에서 O/N해야한다고 하여서 냉장고에서 30v 0.15A로 16시간 트랜스퍼하였습니다.

겔에 염색을 해보니 단백질 거의 남아있지 않아서 트랜스퍼가 잘 된줄 알았는데 멤브레인에 워싱 10분씩 3번하고 1차안티 18시간 붙이고 워싱3번하고 2차안티 1시간 붙이고 워싱 3번하고 형광물질 붙이고 이미지를 찍고 확인해봤는데 밴드가 전혀 1도 안보입니다ㅜㅜ 트랜스퍼를 너무 오래해서 멤브레인을 넘어간 걸까요? 머가 문제인지 잘 모르겠습니다.ㅜㅜ

그리고 80~130kDa처럼 단백질크기가 커도 꼭 트랜스퍼 O/N안해도 되나요?

원래 평소에 50kDa 이하단백질을 보려고 할때 12%gel에 트랜스퍼할때 실온헤서 스티로폼 박스에 트랜스퍼통 넣고 주변을 얼음으로 감싸고 통 안에 아이스팩넣고 100v 0.4A 1시간30분을 하였습니다. 30분마다 아이스팩도 갈아주었고요. 근데 트랜스퍼끝나고 멤브레인 꺼낼때 보면 버퍼가 조금 따뜻합니다. 온도에 많은 영향을 받는걸로 아는데 아이스팩 교체 시간을 짧게 해야할지 어떻게 해야될지 모르겠습니다.ㅜㅜ도와주세요.

 

#western blot
 
#transfer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
limefizzio  |  08.18 16:40   

16시간 트랜스퍼한게 문제인거같습니다.

1시간반해도 충분한데 왜 굳이 16시간을,,, 바꿔보세요

456  |  08.18 16:59   

50 kDa이 transfer 되는 조건에서 130 kDa짜리도 문제 없이 잘 됩니다.

primary antibody가 문제인걸로 보이는데, affinity가 더 높은걸로 새로 구매하세요.

앞다리oneday  |  08.18 17:41  

근데 항상 트랜스퍼를 실온에서 100v 0.4A에 1시간 30분하고 겔을 염색해보면 위부분 단백질은 겔에서 나타납니다ㅜㅜ 위에 부분이 잘안된는거 같은데 어떻게 해야하나요?

마커는 잘 옮겨갑니다!

그럼 130kDa도 실온에서 100v 0.4A에 1시간 30분으로 해도 되나요?

겔조성만 8%로 변경하고 다 동일하게 해도되는건가요?

456  |  08.18 23:23   

마커 이동했으면 문제없다고 판단되고요.

굳이 더 gel에 있는 protein을 trnasfer하고 싶다면 시간 늘리세요. 그리고 transfer를 100% 다 해야한다는 강박관념에 사로잡힐 필요가 없습니다

앞다리oneday  |  08.19 10:34  

멤브레인에 마커는 다 이동했는데 겔을 염색하면 항상 윗부분은 단백질이 염색되서 마커가 이동해도 트랜스퍼가 잘 안됬을수도 있겠다라는 생각이 들더라구요ㅜㅜ

-_-  |  08.19 10:44   

마커가 필터페이퍼에 찍혀야 오버블롯이라고 보시면 되고...

그냥 안티바디가 문제 아닌가요? 다른 종류의 실험(예를 들어 IHC, IF)에선 잘 되나요?

옥낭자  |  08.19 14:02   

1. Ponceau S solution 염색으로 단백질이 남아 있는지 보세요

2. GAPDH나 beta-actin과 같은 잘 확인되는 항체로 밴드 확인해보세요

3. ECL solution을 고감도로 바꿔보세요

 

위 방법으로 확인해보세요.

1번 시약이 없을 시 2번으로 확인해보세요.

2번은 나오는데 밴드가 안나온다면 3번으로 바꾸시는걸 추천합니다.

 

항체마다 양상이 달라요~

앞다리oneday  |  08.19 14:09  

저희 실험실은 antibody를 모두 cellsignaling 제품을 사용하고 있습니다.

아직 웨스턴만 하고 있어서 IHC, IF에 대한 결과는 모릅니다.ㅜㅜ

GAPDH 처럼 40kda대 사이즈는 잘 나타납니다.

60kDa이상의 안티를 붙이면 안보입니다.ㅜㅜ60kDa이상을 보려고 겔 10%로 만들어서 하고 130kda를 볼때는 겔 8%로 하였습니다.

하나 더 질문이 있는데요. 혹시 트랜스퍼할때 전압값이 중요한가요? 전류는 겔 사이즈에 따라 변경하는 것이라고 하는데 그게 맞나요?

 

 

456  |  08.19 20:01   

저포함 여러 사람들이 말하는 내용을 이해 못하시내요.

 

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