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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 관련 조언 부탁드립니다.
알실험알못(대학원생)  | 08.18 13:27

안녕하세요. PCR 관련해서 조언을 얻고자 글 올립니다.

다른 DNA plasmid 몇 가지를 동일한 조건으로 PCR을 진행하였는데 다 비슷한 부분에서 band 가 생깁니다....

원하는 부위의 band가 맞긴한데 나오면 안되는 샘플에서도 band가 나오니, 실험의 결과를 믿기가 어려워 조언 구합니다.

왜 이런 결과가 나타나는건지 아시는 분 있으시면 댓글 부탁드립니다. ㅠ.ㅠ

감사합니다.

 

동일한 primer F,R (농도 : 100pmol) / 5x PCR Master Mix (rTaq) / DW 를 사용했고, PCR 온도는 서치하면 나오는 기본적인 protocol 에 명시되어 있는 온도로 지정했습니다. (Tm 값은 primer 보다 5도 낮게 진행하였습니다.)

* 1, 2, 3 모두 다 다른 샘플입니다....

1, 3 은 원하는 band가 맞는데 2는 아예 band가 나오면 안된다고 생각했는데 나온거라 1, 3의 결과도 믿을 수 없는 상황입니다....ㅜㅜ

upload_image

 

 

#PCR
 
#band
 
#primer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.18 13:35  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 원하는 크기가 얼마인가요?

 

- 2번은 어느 band가 증폭된건가요?

알실험알못  |  08.18 13:46  

예상하는 크기는 106 bp 로 마커 제일 아래 선 정도로 예측하였습니다.

2번 사진에서2, 3 well에 로딩된 굵은 부분을 밴드라고 생각했는데 아닌가요?

만약 아니라면 어떤거라고 생각해야 되는지 알려주실 수 있을까요?ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  08.18 14:14  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 2번의 왼쪽은 증폭이 된것으로 보이기는 하지만 전체 적으로 비특이 band가

많아서 정확히 확인하기가 힘듭니다.

 

- 2번은 primer가 붙는 자리가 없나요?

 

- template를 줄이는 것이 좋을 듯 합니다.

알롤로야놀자  |  08.18 15:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

보통 나오면 안되는게 나왔다면 시약에서 오염이 났을 가능성이 있고요, 아니면 mixture 제작중에 오염이 나서 band가 나왔을 수도 있습니다.

개인적으로 전반적으로 band들이 모두 긁혀서 나온게 gel의 상태가 좋지 못한거 같고 원래 전기영동으로 내리면 PCR할 때 증폭되지 못한 primer들이 아래에 band처럼 남기도 합니다. 

그래서 두번째 사진의 band가 다른 1,3번 사진에 비해 뚜렷하지 않아 band가 아닐수도 있다고 생각이 드네요

그리고 NC는 따로 안 거셨는지? 그것과 비교해서 보통 오염의 여부를 확인하는데 NC가 없어서 확신을 하기가 어렵네요 

저는 개인적으로 실험할 때 primer를 10pmol로 써서 다시 PCR을 하실 때

1) 100pmol primer 그대로 mixture + DNA

2) 100pmol primer 그대로 mixture + D.W

3) 10pmol primer mixture + DNA

4) 10pmol primer mixture + D.W

이렇게 다시 PCR 돌려서 확인해보시길 권장드립니다.

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