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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 669  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 Bradford Protein 단백질 정량하는법
올챙이하윰(대학원생)  | 08.16 08:53

lab실 마다 정량 방법이 달라서...

Bradford로 어떻게 정량해야하질 모르겠어요. 아직 아무도없어서 포로토콜 잡아가는단계되요.. 어떻게 하면  std와 sample을 어떻게 처리해야할지알려주세요.

너무 답답해요... 이해도 잘안되고요 

#western blot
 
#Bradford asassy
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.16 09:00  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- kit를 사용하나요?

 

- assay방법은 어디에서 참고했나요?

올챙이하윰  |  08.16 11:20  

키드를 사용한거는 아니고요... 그냥 브릭에 있는것들보고 참고해서 했어요 ... 

bio-rad regard 시약 따로 있던데요 

 

단백질 정량 (bradford assay 프로토콜있음) > BRIC (ibric.org) 여기참고했어요

 

 

대왕개구리SPEED  |  08.16 12:16  

- 잘못된 방법입니다.

 

- assay에서 가장 중요한 것은 STD와 시료 모두 측정 부피가 동일해야 합니다.

 

- 예를 들어 STD 각 농도 모두 5ul를 측정하면 시료도 5ul 측정해야 합니다.

 

BSA (ug/ml) 0 2 4 6 8 10 12 14
D.W(ul) 800 798 796 794 792 790 788 786
Reagent(ul) 200 200 200 200 200 200 200 200
Total(mL) 1 1 1 1 1 1

1

1

 

위의 표에서 BSA 부피가 동일해야 합니다.

올챙이하윰  |  08.16 14:13  

5ul 이 어디서 나온건가요? 어떻게해서 된다는거죠?

대왕개구리SPEED  |  08.16 14:30  

- 5ul는 예를든것이고 STD, sample 모두 동일 부피로 측정하면 됩니다.

올챙이하윰  |  08.17 09:13  

그러면 d.w양은 그대로하면될까요? 표에 주신내용으로 

대왕개구리SPEED  |  08.17 10:18  

- 시료가 동일하게 들어가면 DW도 동일하게 들어갑니다.

올챙이하윰  |  08.17 10:47  
          BSA Stock soluntion : 1mg/ml      
BSA(mg/ml) 0 0.3125 0.625 0.125 0.25 0.5 1      
       
BSA(ul) 5 5 5 5 5 5 5   sample  5ul
D.W(ul) 795 795 795 795 795 795 795   D.W(ul) 795ul
1x Reagent(ul) 200 200 200 200 200 200 200   1x Reagent(ul) 200ul
Total(mL) 1 1 1 1 1 1 1   Total(mL) 1

이렇게 하면 될까요? 

대왕개구리SPEED  |  08.17 10:59  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
올챙이하윰  |  08.17 11:50  

정말감사합니다. 

올챙이하윰  |  08.17 12:10  
                 
BSA(mg/ml)                
        평균 O.D        
0 0.319 0.324 0.324 0.322        
0.03125 0.322 0.325 0.323 0.323        
0.0625 0.327 0.33 0.33 0.329        
0.125 0.345 0.348 0.345 0.346        
0.25 0.369 0.371 0.372 0.371        
0.5 0.429 0.424 0.424 0.426        
1 0.481 0.488 0.492 0.487        
                 
                 
                 
brodford assay              
BSA Stock soluntion : 1mg/ml  
BSA(mg/ml) 0 0.03125 0.0625 0.125 0.25 0.5 1  
   
BSA(ul) 5 5 5 5 5 5 5  
D.W(ul) 795 795 795 795 795 795 795  
1x Reagent(ul) 200 200 200 200 200 200 200  
Total(mL) 1 1 1 1 1 1 1  
               

 

ㄸ또 희석된서 sample 범위에 안나와요

대왕개구리SPEED  |  08.17 12:17  

- 시약은 어디서 구매했나요?

 

- BSA는 어떻게 만들었나요?

 

 

올챙이하윰  |  08.17 13:19  

BSA를 1mg/ml을  20ul 따서 

0.5mg/ml는 1mg/ml를 20ul따서 D.W 20ul 녹였어요 . 나머지도 동일하게 했습니다

근데 생각해보니 1mg/ml에서 5ul따서 d.w 795에 녹이고 하면, regard시약 200ul 따면 또 희석이 되는거마죠..?ㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  08.17 13:35  

- sample or STD 10ul + 1X 시약 1ml -> mix -> RT 5min -> 측정 해보세요.

올챙이하윰  |  08.17 14:11  

D.W없이 Total 1ml 하면 될까요?

올챙이크리스12  |  08.19 16:58  

[SPEED님께 질문 드립니다!]

SPEED님 감사드려요. 저도 지금까지 잘못된 방법으로 실험하고 있었습니다...

그렇다면 BSA 용액 자체를 DW에 다양한 농도로 dilution 완료한 후에

동일한 volume을 사용해야 한다는 말씀이신 것 맞나요??

정말 감사합니다.

대왕개구리SPEED  |  08.19 17:13  

- 그렇다면 BSA 용액 자체를 DW에 다양한 농도로 dilution 완료한 후에

동일한 volume을 사용해야 한다는 말씀이신 것 맞나요??

: 네..

BSA stock에서 농도별로 취해서 assay하는 것이 아니라 stock을 사용해서

농도별로 우선 만든 후 모든 STD point와 sample을 동일 부피로 assay하면 

됩니다.

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