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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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질문 Gelatin zymography 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ band가 아에 없어요,,,
올챙이sjsj3636(대학원생)  | 08.13 16:01
안녕하세요 zymography를 처음 해보는 석사생입니다ㅠㅠ 도움 받을 분이 없어서 혼자 진행해봤는데요,,
Gelatin zymography를 통해서 MMP-9의 활성을 보려고 했는데 밴드가 아에 뜨지를 안습니다,,

Sample을 prep은 먼저 6웰 플레이트에 A549 cell을 깔고 부착후 starvation하였고 후에 cell을 자극하고 시료를 처리하여 conditioned media를 모았습니다(starvation부터 모든 media는 SF media를 사용했구요)
이 샘플로 MCP-1 등의 ELISA 측정을 하였고 최종적으로 zymography를 수행했습니다,,!ㅠㅠ

Zymography의 모든 젤과 시약은 invitrogen novex제품을 사용했는데요,
Conditioned media를 LDS sample buffer(4x)로 4배 희석시켜준 후에 로딩하여 90V로 3-40분 정도 전기영동하였고 후에 renaturing buffer(1x)에 30분, developing buffer(1x)에 30분 상온에 둔 후 새로운 developing buffer로 교체하여 37도에서 overnight 했습니다.
후에 wash 3회 진행하였고 simplyblue safestain으로 1시간 gel 염색 후 d.w로 1시간 탈색하였습니다.

근데 아에 밴드가 뜨질 않아요,, 염색 후에도 밴드가 안보였으나 그대로 진행해봤는데,,

왜 안뜨는걸까요?,,, 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
#Gelatin zymography
 
#Zymogram
 
#MMP-9
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
앞다리prot  |  08.13 16:05  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

conditioned media 모으고 나서 혹시 농축과정은 없었나요?

올챙이sjsj3636  |  08.13 16:34  
따로 진행하지 않았습니다ㅠㅠ 제가 protocol 짤때 전기영동 시간이 1시간-2시간 정도로 알았는데 생각보다 훨씬 빠르게 내려오더라고요,, 이 시간은 크게 상관이 없나요?ㅠㅠ
대왕개구리SPEED  |  08.13 17:19  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- PC를 따로 확인하지 않았나요?

 

- loading은 어느정도 했나요?

 

- 48hr 반응도 생각해 보세요.

올챙이sjsj3636  |  08.13 17:41  
PC가 marker 말씀하시는 건가요?,,
Marker밴드만 나와있고 sample은 아에 아무 밴드가 없어요,,
로딩은 sample buffer에 희석한 sample을 10ul 로딩했습니다!ㅠㅠ
대왕개구리SPEED  |  08.13 18:01  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- PC는 MMP-9입니다.

 

- 양이 적은지, 방법에 문제가 있는지 확인이 필요할 것 같습니다.

 

- 양이 적은지는 반응 시간을 길게하면 약하게나마 band가 나올겁니다.

 

- 이럴 경우 sample을 농축해서 실험하면 됩니다.

 

- 반응 시간을 길게, 시료를 농축해도 band가 안나오면 실험 방법에 문제가

있는 것으로 보고 해결하면 됩니다.

올챙이sjsj3636  |  08.13 18:37  
감사합니다! Mmp-9은 따로 두지 않았고 western marker를 사용했습니다!
반응 시간을 길게하는건 볼트를 낮추고 시간을 길게 보라는 말씀이시죠??????
감사합니다ㅠㅠㅠㅠ
대왕개구리SPEED  |  08.13 19:27  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 반응은 37도에서 하는 것을 말하고 24시간에서 안나오면 48시간까지 반응을

해 보세요.

 

- MMP-9을 같이 전기영동 하는 것은 zymography에 문제가 없는지 확인하는

방법입니다.

올챙이sjsj3636  |  08.13 19:38  
감사합니다!!!!
앞다리prot  |  08.14 21:13  

양이 별로 없어서 쿠마시 염색했었을 때 안 보인 것일 수 도 있으니

centrifugal filter나 혹은 amicon tube 등을 이용해서 media를 농축시켜서 한번 시도해보시기 바랍니다. plate에서 media 모은 후 cell debris는 down 시킨 다음 위의 sup 따셔서 농축하시면 됩니다. 농축하시고 sample마다 정량도 해서 loading 하시면 됩니다.

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