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BioLab 이은열 교수
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Transfer 도와주세요ㅜㅜ
올챙이쿵쿠따리쿵쿠따(대학원생)  | 08.13 11:24
트랜스퍼를 하는데 37kDa짜리는 혹시 100V, 2시간을 하면 다 넘어가 버리나요? 오늘 두개의 멤브레인을 디텍 했는데 샘플이 만약 6개라고 하면 loading control이라서 6개가 다 나와야 정상인데 일부만 디텍 된다거나 아예 나오지가 않습니다 ㅜㅜ



혹시 37kDa 크기는 보통 어느정도 진행해야 하나요?

그리고 130kDa정도의 protein도 저정도면 너무 오버 된 걸까요?

130kDa도 안 나와서요ㅜㅜ(130kDa은 background는 뜨는데 밴드가 안 떠요)

Target protein이 250kDa이라서 100V 2시간 해주고 37,100(130보려고 100에서 잘라줘요)부분만 잘라서 붙여주는데 일부만 보이거나 아예 안 보여요ㅠㅠ
(Target protein은 그래도 보이긴 보임)

젤은 10% 사용하고 있습니다!

바뀐점은 로딩 양이 20에서 절반으로 줄은 점 밖에 없는데 이게 요인이 될 수 있나요?
만약 transfer 볼트와 시간이 문제라면 어느정도가 적당 할까요? 단백질 로딩 양도 20으로 해야 할까요?

-제가 웨스턴 한 지 별로 안 돼서 정말 혹시나 두 멤브레인을 바꿔서 ab를 붙였나 생각도 해봤는데요. 트랜스퍼 후 membrane에 윗 부분(여유가 있는 부분)쪽부터 크기가 커짐->작아짐 아닌가요?
#Transfer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
456  |  08.13 18:24   

지속적으로 위 문제가 발생하는건가요?

간헐적으로 위 문제가 발생한건가요?

이번 한번만 위 문제가 발생한건가요?

 

올챙이쿵쿠따리쿵쿠따  |  08.13 18:26  
456님!

지금 같은 실험을 일주일에 두번씩 진행 중인데 이번주 두번 다 저렇네요 ㅜㅜ
전에 100V,2시간 했을 때는 괜찮게 나왔습니다 ㅜㅜ
456  |  08.13 18:37   

그렇군요.

그러면, marker를 양쪽에 loading하고 transfer를 했을때, 동일하게 gel에서 PVDF membrane으로 transfer가 되었는가요?

Antibody는 dilution을 해둔걸 사용했나요, 새로 dilution 한걸 사용 했나요?

Ponceau S staining을 통해 PVDF membrane에 transfer가 잘된걸 확인 했나요?

올챙이쿵쿠따리쿵쿠따  |  08.13 18:46  
마커는 잘 transfer 됐구요!
Antibody는 dilution 돼 있는 걸 사용 했습니다! 다만 별로 사용하지 않은, 최근에 만들어 놓은 안티바디 사용 했습니다.
폰슈 염색은 아직 진행하지 않았는데, 내일 해 볼 예정 입니다!
만약 폰슈 해서 염색이 안 된다면 transfer 시간을 조절 해야 할까요?
456  |  08.13 19:48   

Marker가 문제없이 transfer되셨다니, ponceasu staining도 아마 문제 없겠내요. 

아마도 transfer문제는 없는거 같은데, antibody dilution한거말고 새걸로 해서 해보세요.

올챙이쿵쿠따리쿵쿠따  |  08.13 21:14  
네 감사합니다! ㅜㅜ
-혹시 글에 마지막 질문인 단백질 사이즈는 gel의 윗부분 부터가 큰 사이즈 맞지요?! 이젠 하다하다 여기서 실수한건가 싶어 여쭤봅니다 ㅜㅜ
-아 그리고 보통 1st antibody는 몇회까지 재활용이 좋을까요?!

질문 폭탄 죄송합니다ㅜㅜ
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