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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 341  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 PCR이 잘 안돼요...
올챙이과지주(대학원생)  | 08.11 13:58

gibson assembly cloning을 하기 위해서

vector를 iPCR을 수행중인데

아무리 primer binding site를 바꿔서 진행을 해도

계속해서 multiband가 뜹니다..

게다가 target site의 band가 너무 연하게 떠요..

primer desgin할 때 2nd structure까지 다 고려하고

snapgene 등을 활용해서 multibinding site 생성 여부까지 확인후 진행했지만

사진과 같은 결과만 나옵니다ㅠㅠ

(위의 밴드가 target 하려는 region과 size가 맞는 밴드입니다.)

(하필 multiband로 뜬 아래에 위치한 band의 size가 iPCR로 잘라내려는 부위가 사이즈가 비슷한것도 마음에 걸리네요)

어떻게 해야 PCR이 성공할 수 있을까요..

클로닝 선배님을 살려주세요..ㅠㅠ

upload_image

#gibson
 
#cloning
 
#iPCR
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뒷다리Anchovy  |  08.11 14:45  

저 라면 
1. PCR tm을 조절해서 다시 PCR 해본다. 
2. Gel ex 해서 그냥 진행한다. 
3. gel ex 해서 원하는 부분을 다시 cloning 해서 그것만 들어 있는 vector를 만들어서 다시 PCR 해본다. 

 정도로 trouble shooting을 진행할 것 같습니다. 

대왕개구리SPEED  |  08.11 15:26  

- 전체적으로 어떤 flow인지 알수 없기 때문에 정확한 조언은 힘들며

multi band 보다 우선 전체적인 smear가 문제로 보입니다.

 

- 이 정도 smear는 정확한 band elution도 힘듭니다.

올챙이과지주  |  08.11 16:37  

primer annealing temperature도 screening과 thermo, NEB 등의 사이트도 활용하여 정했습니다..! 그리고 multiband해결을 위해서 annealing time도 최소시간은 30초로 줄여서 진행하였고 cycle수도 최소인 25로 진행했습니다..ㅠㅠ글ㄴ데도 이러하여 고민이네요,,,

smear는 어떻게 해결하나요...?ㅠㅠ

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