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질문 단백질 정제시 문제
정제  | 2009.03.24 16:56
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

안녕하세요^^
제가 원하는 원하는 gene을 pGEX-4T-1에 cloning 한 후
rosetta(DE3)에 transformation 한 다음 IPTG로 인덕션하여 하베스트하여,
코마시로 발현을 확인 하였구요.
sonication 해서 마찬가지로 코마시로 확인한 결과 insoluble인것을 확인하였습니다.

GST는 insoluble상태로는 정제하기 힘들다고 하여,
soluble form으로 발현하고자 여러 조건(1mM~0.1mM IPTG, 20~30온도)에 변화를 주어 발현 조건을 잡아 보았지만 실패하였습니다.(20~25온도에서는 그냥 발현자체를 보는것도 실패하였습니다..왜그런걸까요..)

그래서 1,3,6,8M Urea로 solubilization한 후 코마시로 확인하니 6M,8M에서 약하게 밴드가 보여
두가지의 샘플에 GST레진을 붙여 정제를 하였으나
코마시 결과 레진에 제가 원하는 프로테인이 바인딩이 안한걸로 보였습니다.
첫번째 워싱에서 다빠졌더군요.

여기저기 찾아보니,
1. solubilization후 투석을 한다음 바인딩을 하는 방법
2. solubilization후 refolding한 후 바인딩을 하는 방법
3. solubilization후 버퍼 pH를 8.0으로 높여 바인딩하는 방법(그전엔 7.0이였음)

이런 방법이 있던데,
브릭고수님들의 생각은 어떠신지요.

답변기다리겠습니다.

#gst
 
#정제
 
#단백질
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리엘피스  |  2009.03.24   
저도 한때 GST가 solubility를 높여줄 것이라는 착각에서 몇개월을 날린 적이 있습니다. deletion mutant를 만드는 과정에서 GST full-down을 하기 위해 자체만으로도 soluble한 protein을 일정한 간격으로 잘라 GST에 tagging한 후 발현정제를 하고자 했지만 wild-type만 빼고 거의 모든 deletion mutant들이 insoluble하게 발현하는 것을 보고 기염을 한 적이 있습니다.
이러한 경우는 이전에도 본적이 있기 때문에 설마했다가 시간과 돈을 낭비한 꼴이 된 것입니다.

이후로는 GST는 거들떠도 보지 않으며 지금은 MBP위주로 사용하고 있으며, 간혹 NurseA를 사용하기도 합니다. TRX가 GST보다는 그래도 soluble하게 발현하는 편입니다만, 거기서 거기입니다.

Insoluble GST를 refolding하여 정제하고 한 실험들은 많이 있으며 성공한 것들이 주로 논문으로 나오곤 하지만 정말 쉬운 일이 아닙니다. GST는 dimer를 형성해야만 GSH resin에 붙으며 또한 refolding조건을 어떻게 잡느냐가 너무나 어려운 일입니다.

반드시 GST가 붙어 있어야 한다면, GST에 his가 더 붙어있는 (가령 pET42a) vector를 이용해 his resin으로 denaturation 조건에서 정제하는 것을 추천해 드립니다.
꽃개구리TX  |  2009.03.25   
음...미리 알아보시고 실험을 하시지요..

GST는 denature된 상태에서는 GST 레진에 붙지 않습니다.

이런 방법을 on column refolding이라고 하는데...

GST인 경우는 불가능합니다. 다만 His tag인 경우는 가능합니다..

정제  |  2009.03.25    
엘피스님께/
그래서 원하는 gene 뒤쪽에 6xhis를 붙여(primer design) 크로닝 후 같은 방법으로 
발현을 시켰는데 발현이 되질 않습니다;;
his를 붙이지 않은 것은 insoluble로 발현은 잘되는데ㅠ
이런경우도 있나요??  
정제  |  2009.03.25    
TX님께/
Pulsatile renaturation으로 gst를 refolding해서 binding해 보려 하는데
헛수고일까요?

저희 실험실 선배는 Urea농도가 높아서 binding을 하지 않을 것이라고 합니다.
1M,3M,6M,8M로 Solubilization하여 1과 3에서는 밴드가 없었지만,
눈에만 안보이니 정제를 해 보라고 하더군요.
선배가 시키니 해 보긴 하겠지만 별로 기대는 되지 않습니다.

gst로 정제를 해야하는 것은 insoluble이고
똑같은 벡터와 원하는 진뒤쪽에 his를 붙여 클로닝한 것은 발현이 되질 않습니다.ㅠ

어떤 방법이 있을까요??
꽃개구리TX  |  2009.03.25   
Pubmed에서 GST refolding으로 검색해보시면 여러편을 찾으실수 있습니다
아시겠지만..모든 GST  fusion protein이 refolding이 되는것은 아닙니다.
어디까지나 case-by-case 입니다.

님께서 질문하신 방법은 dilution에 의한 refolding을 말씀하시는것 같은데...
역시 해보지 않고서는 뭐라 말씀드리기 그렇네요..

dilution할때 사용하는 refolding buffer는 대략 2M 정도의 Urea를 씁니다만,
이 단계에서는 대체적으로 aggregation이 일어나지 않을겁니다..
그런데 Urea를 완전히 제거하면 거의 대부분 aggregation으로 떨어지더군요..
그래도 supernatant에 보면 soluble한 protein이 있을수 있습니다.
하지만 GST가 misfolding으로 soluble하게 된 경우도 있습니다.
이런 경우는 GSH bead에 붙지 않고 모두 flow-through로 빠져 나올수 있습니다.

하지만 이런 경우를 잘 피해서, 님의 단백질이 soluble하게 정제될수 있기를 바랍니다..

엘피스님께서 설명하신 maltose binding protein (MBP) fusion 이 GST보다 확실히 soluble한것 같습니다. vector는 New England Biolabs(NEB)사에서 취급하고 있으니 한번 고려해 보심도 좋을듯....


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