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stripping해서 같은 gel에서 detection하거나,
같은 셈플을 여러번 내려서 total, phospho 따로 찍으면 됩니다.
phosphorylation sites를 2개이상 찍을 수도 있기 때문이죠.
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레벨4
experiment
(대학원생)
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22.08.05 13:44
456님, 제가 조금 헷갈리게 작성했나 봅니다!
네, 제가 한 방법이 그 방법입니다. 각각 다른 gel에서 같은 샘플 동시에 내려서 p-AKT, AKT 각각 찍었는데요.
질문은
1. 한 안티바디를 찍고 워싱 후 다음 안티바디를 붙여서 찍는게 나을지(이 경우에 phospho form와 total form 중 어느것을 먼저 붙이는게 맞을까여) 아니면 제가 한 방법대로 gel 두개 내려서 각각 보는게 나을지입니다. 큰 차이가 없는건가 궁금합니다.
2. 두 gel에서 따로 찍었다면 그 gel 각각의 b-actin으로 정량을 해주어야 하는게 맞는지 궁금합니다.
- p-AKT/b-actin (Gel 1) =X
- AKT/b-actin (Gel 2) =Y
- X/Y
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레벨1
1461hj
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22.08.05 14:35
washing 해도 저는 완전히 blot이 지워지지 않더라고요...
같은자리 detect하실 거라면 다른 membrane에서 각자 잡는게 좋을 것 같습니다 ㅎㅎ
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레벨4
experiment
(대학원생)
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22.08.05 15:18
1461hj님!
그죠? 저도 그 부분이 가장 우려되더라구요,, 답변 감사합니다.
일반적으로 phopho를 먼저 보고 total을 보는데요. antibody 마다 sample의 soruce마다 p-, total-AKT signal이 다 다르니, stripping과정을 적용한 상황에서 본인 스스로 주관적으로 판단해서 같은 gel 다른 gel해야 할지 선택을 해야 하고요.
sample간 정량이 모두 끝났다면 굳이 각 gel 마다 AKT/b-actin, p-AKT/b-actin을 계산한뒤에 p-AKT/AKT로 계산을 안해도 된다고 봅니다. 바로 p-AKT/AKT로 해도 무방합니다. 결국 유의미한 차이를 보이는거는 어떻게든 차이가 나기 마련입니다.
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레벨4
experiment
(대학원생)
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22.08.05 15:57
456님! 다시 한번 답변 달아주셔서 감사합니다:)