[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
엘앤씨바이오
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
전체보기 안전점검 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 317  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 웨스턴에서 p-AKT와 AKT 안티바디 찍어보신분 (같은 size에서 뜨는 band detection하는법)
앞다리experiment(대학원생)  | 08.05 12:18

제목 그대로, p-AKT와 AKT를 디텍션하려고 하는데, 둘 다 60 kDa에서 뜨는 안티바디라서요. 첨엔 두 gel을 만들어서 각각 찍고 정량을 해봤는데 같은 샘플이어도 gel마다 크리티컬하진 않아도 좀 차이가 있길래 혹 같은 gel에서 찍어야 할까요?

하나 먼저 찍고 washing 후 같은 membrane으로 다음 안티바디 붙여서 찍는걸 추천하시나여? 아님 그냥 각각 다른 gel에서 찍고 정량해도 큰 문제 없을까요?

(+)덧붙여, 각각 다른 gel에서 찍었을경우 p-AKT, AKT를 각각의 gel에서 뜬 b-actin으로 정량한 후 그 값을 p-AKT/AKT로 계산하나요, 아니면 p-AKT, AKT 각각의 밴드만 image J로 정량한 후 그 값을 바로 p-AKT/AKT ratio 값으로 계산하시나요?

#웨스턴블랏
 
#westernblot
 
#AKT
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
456  |  08.05 12:45   

stripping해서 같은 gel에서 detection하거나,

같은 셈플을 여러번 내려서 total, phospho 따로 찍으면 됩니다.

phosphorylation sites를 2개이상 찍을 수도 있기 때문이죠.

앞다리experiment  |  08.05 13:44  

456님, 제가 조금 헷갈리게 작성했나 봅니다!

네, 제가 한 방법이 그 방법입니다. 각각 다른 gel에서 같은 샘플 동시에 내려서 p-AKT, AKT 각각 찍었는데요.

질문은

1. 한 안티바디를 찍고 워싱 후 다음 안티바디를 붙여서 찍는게 나을지(이 경우에 phospho form와 total form 중 어느것을 먼저 붙이는게 맞을까여) 아니면 제가 한 방법대로 gel 두개 내려서 각각 보는게 나을지입니다. 큰 차이가 없는건가 궁금합니다.

2. 두 gel에서 따로 찍었다면 그 gel 각각의 b-actin으로 정량을 해주어야 하는게 맞는지 궁금합니다. 

- p-AKT/b-actin (Gel 1) =X

- AKT/b-actin (Gel 2) =Y

- X/Y

알1461hj  |  08.05 14:35  

washing 해도 저는 완전히 blot이 지워지지 않더라고요...

같은자리 detect하실 거라면 다른 membrane에서 각자 잡는게 좋을 것 같습니다 ㅎㅎ

앞다리experiment  |  08.05 15:18  

1461hj님!

그죠? 저도 그 부분이 가장 우려되더라구요,, 답변 감사합니다.

456  |  08.05 15:32   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일반적으로 phopho를 먼저 보고 total을 보는데요. antibody 마다 sample의 soruce마다 p-, total-AKT signal이 다 다르니, stripping과정을 적용한 상황에서 본인 스스로 주관적으로 판단해서 같은 gel 다른 gel해야 할지 선택을 해야 하고요.

sample간 정량이 모두 끝났다면 굳이 각 gel 마다 AKT/b-actin, p-AKT/b-actin을 계산한뒤에 p-AKT/AKT로 계산을 안해도 된다고 봅니다. 바로 p-AKT/AKT로 해도 무방합니다. 결국 유의미한 차이를 보이는거는 어떻게든 차이가 나기 마련입니다.

앞다리experiment  |  08.05 15:57  

456님! 다시 한번 답변 달아주셔서 감사합니다:)

답변하기
할인행사/신제품신기술 광고 검색광고
JW크레아젠 JW크레아젠
JW크레아젠 사이토카인 Event! (10.23까지)
나노팬텍 나노팬텍
3차원 세포배양용기를 사용하여 기존 2차원 세포배양의 한계를 극복해보세요! (11.30까지)
바이오닉스 바이오닉스
[TECAN No.1 한국공식대리점] TECAN Automation / Liquid handler / Mic.. (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
GFP보다 강한 fluorescence signal : NEB SNAP&CLIP tag protein lab..
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
간소화, 현대화, Phage Display Peptide Library Kit v2 소개합니다.
JW크레아젠 JW크레아젠
JW크레아젠 Thermo 기초장비 Event! (10.23까지)
최근등록   더보기 >
western 시 sample cooking   10.06
mouse setup   10.06
Citric acid/phosphate buffer를 pH 4.0에서 6.8로 transi...   10.06
EB agarose 뜻   10.05
세균 100배율 관찰 분석   10.05
셀 카운팅 시 챔버에 보이는   10.05
그럼염색에 따른 향균실험   10.05
mouse 조직면역염색 4color 관련   10.05
Glutaraldehyde solution 10*1ml 사진   10.05
농도   10.05
최근답변자 우수답변자
대왕개구리SPEED

올챙이Ginger Bak..

뒷다리새슬

개구리Marine

개구리clickclick

올챙이필1

개구리cslee

알무농약감자

꽃개구리juno

개구리propadrum

개구리secu

개구리ryan

개구리닥눈삼

꽃개구리스카이

개구리식스센스

개구리빛초롱

실험관련연재
세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고