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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 웨스턴에서 p-AKT와 AKT 안티바디 찍어보신분 (같은 size에서 뜨는 band detection하는법)
앞다리experiment(대학원생)  | 08.05 12:18

제목 그대로, p-AKT와 AKT를 디텍션하려고 하는데, 둘 다 60 kDa에서 뜨는 안티바디라서요. 첨엔 두 gel을 만들어서 각각 찍고 정량을 해봤는데 같은 샘플이어도 gel마다 크리티컬하진 않아도 좀 차이가 있길래 혹 같은 gel에서 찍어야 할까요?

하나 먼저 찍고 washing 후 같은 membrane으로 다음 안티바디 붙여서 찍는걸 추천하시나여? 아님 그냥 각각 다른 gel에서 찍고 정량해도 큰 문제 없을까요?

(+)덧붙여, 각각 다른 gel에서 찍었을경우 p-AKT, AKT를 각각의 gel에서 뜬 b-actin으로 정량한 후 그 값을 p-AKT/AKT로 계산하나요, 아니면 p-AKT, AKT 각각의 밴드만 image J로 정량한 후 그 값을 바로 p-AKT/AKT ratio 값으로 계산하시나요?

#웨스턴블랏
 
#westernblot
 
#AKT
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
456  |  08.05 12:45   

stripping해서 같은 gel에서 detection하거나,

같은 셈플을 여러번 내려서 total, phospho 따로 찍으면 됩니다.

phosphorylation sites를 2개이상 찍을 수도 있기 때문이죠.

앞다리experiment  |  08.05 13:44  

456님, 제가 조금 헷갈리게 작성했나 봅니다!

네, 제가 한 방법이 그 방법입니다. 각각 다른 gel에서 같은 샘플 동시에 내려서 p-AKT, AKT 각각 찍었는데요.

질문은

1. 한 안티바디를 찍고 워싱 후 다음 안티바디를 붙여서 찍는게 나을지(이 경우에 phospho form와 total form 중 어느것을 먼저 붙이는게 맞을까여) 아니면 제가 한 방법대로 gel 두개 내려서 각각 보는게 나을지입니다. 큰 차이가 없는건가 궁금합니다.

2. 두 gel에서 따로 찍었다면 그 gel 각각의 b-actin으로 정량을 해주어야 하는게 맞는지 궁금합니다. 

- p-AKT/b-actin (Gel 1) =X

- AKT/b-actin (Gel 2) =Y

- X/Y

알1461hj  |  08.05 14:35  

washing 해도 저는 완전히 blot이 지워지지 않더라고요...

같은자리 detect하실 거라면 다른 membrane에서 각자 잡는게 좋을 것 같습니다 ㅎㅎ

앞다리experiment  |  08.05 15:18  

1461hj님!

그죠? 저도 그 부분이 가장 우려되더라구요,, 답변 감사합니다.

456  |  08.05 15:32   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일반적으로 phopho를 먼저 보고 total을 보는데요. antibody 마다 sample의 soruce마다 p-, total-AKT signal이 다 다르니, stripping과정을 적용한 상황에서 본인 스스로 주관적으로 판단해서 같은 gel 다른 gel해야 할지 선택을 해야 하고요.

sample간 정량이 모두 끝났다면 굳이 각 gel 마다 AKT/b-actin, p-AKT/b-actin을 계산한뒤에 p-AKT/AKT로 계산을 안해도 된다고 봅니다. 바로 p-AKT/AKT로 해도 무방합니다. 결국 유의미한 차이를 보이는거는 어떻게든 차이가 나기 마련입니다.

앞다리experiment  |  08.05 15:57  

456님! 다시 한번 답변 달아주셔서 감사합니다:)

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