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질문 vector double digest 질문
알근당근당(대학생)  | 08.04 16:50

안녕하세요.

vector를 BamHI, XhoI으로 double digestion하고 있습니다.

(vector에 다른 Bam, xho site는 없습니다.)

그런데 RE처리 할 때 Bam,Xho로 한번에 처리하니 extra band가 생기고, 이상해서

1. Bam

2. purify (pcr purification , D.W 40 Elu) 

3. Xho 

이 순서로 digestion 했습니다.

이때 2번과정 이후 EP를 내려보니 3개의 band가 형성되었는데,

3번 Xho 효소를 처리한 후, 다시 EP를 내려보니 하나의 band만 남은 것으로 확인되었습니다.

upload_image

 

결과는 이렇게 나왔습니다.

 

1. BamHI이  star activity가 있다고 알고 있는데 그래서 enzyme을 너무 과량으로 넣어서 그런건가요?

 

2. Bam -> purify -> xho 까지 하고 나니 band가 다시 정상적인 size의 band로 나왔는데 이것도 왜그런 것인지 모르겠습니다.

3. 이 sample들 모두 버리고 다시 xho, Bam순서로 진행해야 할까요?

#double digest
 
#Bam
 
#Xho
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.04 17:07  

- BamHI 처리가 잘 안되는 것은 vector 상태가 안좋아서 그렇습니다.

 

- XhoI으로 1band가 나온것은 XhoI으로 잘려서 그렇습니다.

 

- 전체적으로 보면 다시 자르는 것이 좋을 듯 합니다.

근당근당  |  08.04 17:20   

안녕하세요 스피드님!

한가지 질문이 있습니다.

당일 miniprep 하고 바로 RE 처리하였는데 

액체배양해논 배지가 좀 오래되었던 것으로 miniprep 하였습니다.

혹시 오래된 것으로 mini prep해서 vector 상태가 안좋은 것일까요?

대왕개구리SPEED  |  08.04 17:57  

- 100% 관계가 없다고는 하기 어렵지만 실험에 사용하는 재료는 항상 fresh한

상태에서 준비하는 것이 가장 좋습니다.

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