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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 431  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 transfer가 일부가 잘 되지 않습니다.
앞다리oneday(대학원생)  | 08.03 17:37

western blot 과정중 항상 transfer한 후 겔을 coomassie에 넣어 transfer이 잘 되었는지 확인을 하는데요.

transfer는 transfer buffer을 가득넣어주고 100V, 0.4A, 1시간30분동안 하면서 통주변에 얼음으로 감싸고 20~30분마다 ice pack도 갈아주고 최대한 안따뜻해지게 해주면서 하는데요.
 

transfer후에 겔을 확인하면 55kDa 정도 위로는 단백질이 남아있습니다.

다행이 저희가 확인하고자하는 단백질은 30~40kDa이지만 완벽하게 transfer가 되지 않는것에 의문이 되는데요. 매번할때마다 이러니 답답합니다. 최대한 nitro cellulose 덮고 whitepaper두장덮고 기포를 빼주기위해서 스크래퍼로 살살 누르고 최대한 밀착되게 마지막에 black, clear plastic으로 꽉 잡아서 transfer을 해줍니다.

머가 문제일까요?ㅜㅜ 도와주세요.

#western blot
 
#transfer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-_-  |  08.03 17:56   

시간은 더 늘려보셨나요?

전류량이나 전압 둘 중 하나를 고정해서 파워 서플라이가 돌아갈 건데 고정하는 옵션을

바꿔보는 건 어떤가요?(전압을 고정했으면 전류량을, 아니면 반대로)

웻 트랜스퍼면 콜드룸이나 냉장고에 넣고 오버나잇으로도 돌릴 수 있는데

전압을 30-40V정도로 해놓고 오버나잇으로도 한번 해보시고요.

 

456  |  08.03 17:59   

55 kDa위로 Marker 조금 남아 있는건가요? 아에 안 넘어 간건가요?

더 오래 해보세요

앞다리oneday  |  08.03 18:04  

55kda위로 마커도 남는데 membrane으로 transfer는 잘 됬습니다.

 

456  |  08.04 10:25   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

그러면 실험진행해도 무방할듯한데요?

모든 사이즈의 단백질을100% transfer 안해도, 원하는 영역이 거의다 넘어갔다면 실험결과해석은 가능합니다. 굳이 100% 해야 겠다면 그냥 시간 늘리시길.

앞다리oneday  |  08.08 10:44  

넵! 감사합니다~

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