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 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
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질문 Jurkat, mouse CD4에서 ChIP sonication 조건잡는데 조언이 필요합니다.
알디디둔둔(대학생)  | 07.28 16:26

안녕하세요 이번에 jurkat이랑 mouse primary CD4+ T cell에서 ChIP을 하고자 ChIP 실험 조건 세팅하고 있습니다. 저희 방이 ChIP을 많이 하지 않아서 경험 많으신 분들의 조언을 구하고 싶습니다.

우선 제가 현재 사용하는 protocol은 upstate에서 나온 protocol을 토대로 진행하고있습니다. T cell이 suspension cell이기 때문에 formaldehye를 처리하기 전에 cell을 걷어서 centri로 다운시키고 media에 풀어서 counting한 뒤 실험을 진행했습니다.

-Add formaldehyde(final conc. 1%) to cells in media, incubate 10min, RT

-Add glycine(final conc. 0.125M), incubate 5min, RT

-Centrifuge at 4℃

-Wash with cold PBS, centrifuge, discard supernatant (repeat 2 times)

- Lysis with 1ml SDS lysis buffer (1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris,pH7.5) per 2 x10^7 cells

-Aliquot lysates 300ul per IP tube --> sonication(bioruptor)

-Centrifuge sonicated sample

-Transfer 10ul from supernatant, mix with loading dye, boil for 3 min, check the fragments by gel electrophoresis(2% agarose gel)

우선 sonication 조건부터 잡으려고 위의 step까지 진행해서 여러가지 sonication 조건으로 test해보고 있는데, 전기영동을 해보면 결과가 다음같습니다.

위 사진은 10sec ON/30sec OFF 를 30cycle(왼쪽lane), 40cyle(오른쪽 lane)로 sonication해본 결과입니다. 저는 대략 500bp 전후의 fragment를 원한는데 왼쪽 lane에서 보면 200bp size쯤에서 band가 확인되고 오른쪽 lane은 거의 band가 보이지 않습니다. 또 양쪽 lane에서 모두 1~3kb에서 smaer하게 보이는 band가 있는데 sonication이 덜된것처럼 보이지만 sonication 조건을 다르게 test해도(30sec ON/ 30sec OFF를 10cycle, 20cycle 해보는 등) 저것과 거의 똑같은 결과가 나옵니다.

1kb 넘는 smear한 band를 최대한 없애려면 sonication cycle을 더 늘려봐야 할까요? 아니면 crosslinking이 너무 과도하게 됐거나 lysis가 제대로 되지 않은 문제일까요? 어떤 부분에서 문제가 되는 것인지 감이 잡히지 않아 고민이 많습니다. ㅠㅠ

또 추가적으로 궁금한 점이 있는데 혹시 formaldehyde처리하기 직전 media에 있는 cell의 농도 또한 중요할까요? counting한 뒤 formaldehyde를 media volume에 맞춰서 넣어줬는데 이때 cell concentration에 대한 부분은 고려하지 못해서 혹시 이것이 큰 문제가 될까 싶습니다.

#ChIP
 
#sonication
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