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레벨5
ʕ•ﻌ•ʔ뀨
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22.07.25 11:59
프라이머주문하신곳에 넣어야하는 농도와 PCR 세팅값이 안적혀있나요?
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레벨5
LCK BD&FAS
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22.07.25 15:40
ThermoFisher Brand Applied Biosystems(ePCR, qPCR, CE, NGS, MA) 국내 공식 대리점 LCKTechnologies입니다.
1. 우선 프라이머 forward reverse를 따로따로 주문하여 받았는데, pcr 돌릴 때 샘플 넣는 한개의 pcr tube에 forward reverse primer를 동일량으로 반씩 넣으면 되는 건가요?
- PCR 진행 시 Forward/Reverse Primer를 반드시 동량으로 넣을 필요는 없습니다. 조건을 잡기 위해 여러 농도의 primer를 사용하여 가장 효율이 좋은 primer 농도를 찾으면 됩니다. 예를 들어 Forward Primer는 final 농도 250nM / Reverse Primer는 final 농도 150nM에서 최적의 효율을 보인다면 각각 250nM/150nM이 될 수 있도록 primer 양을 조절하여 사용하면 됩니다.
2. 참고한 논문에서 PCR amplification conditions on the Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System: 58'C for 5 minutes; 95'C for 2 minutes; 40 cycles of 95'C for 15 seconds and 60'C for 60 seconds.
이라고 적혀있는데, 58'C - 95'C - (95'C-60'C)x40 이렇게 진행된다는건가요? 처음을 58'C로 시작하는건 선배들 pcr template중에 없엇거든요ㅠ
- 58'C for 5 minutes은 PCR master mix에 UDG or UNG라는 enzyme으로 carryover product를 제거하는 step으로 사용하는 master mix에 UDG or UNG가 들어가 있지 않다고 하면 생략해도 무관합니다.
3. 상대정량위해 GAPDH로 nomalization할 예정인데, gapdh 세팅값은
95'c - 54'c 20cycle -72'c로, 제가 쓸 프라이머들이랑 세팅값이 다릅니다. pcr 돌릴 때 예를 들어 8-strip-tube를 사용하면, 한 줄 튜브에 같이 못돌리고 따로따로 돌려야 되는것인가요?
- 사용하고자 하는 장비에 따라 다르겠지만, 사용하고자 하는 장비가 Applied Biosystem의 StepOne Plus, QuantStudio3/5가 아니라고 하면 primer의 annealing Tm은 비슷하게 제작하는 것이 좋습니다. StepOne Plus, QuantStudio3/5의 경우 sample block의 well별로 묶어 여러 개의 온도 zone으로 하여 primer의 annealing Tm 값 별로 PCR이 가능합니다. 다른 장비의 경우 annealing Tm 값 별로 PCR이 불가능하기 때문에 Primer의 annealing Tm을 58~60℃가 될 수 있도록 design 하여 같은 batch에서 실험 진행하는 것을 권장합니다. 이 경우는 GAPDH를 다시 design 하는 것이 더 좋을 수 있습니다.
다른 문의 사항 있으시면 fas@lcktech.co.kr로 연락 주시기 바랍니다.