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mouse ESC 분주시 발생한 문제 질문
레벨1 백근영 (대학원생)
안녕하세요.
제가 ATCC에서 구입한 mESC(ES-E14TG2a)를 배양하면서 문제가 생겨 질문 남깁니다.
발생한 문제는, 세포를 처음 해동하고 풀었는데, 하루가 지나도 부착되지 않고 부유한 상태로 존재하고 있습니다.
원래 embryonic cell을 배양할때, 분화를 방지하고 세포 부착을 위해 feeder cell을 공동 배양하게 되는데,
저는 이후 실험을 위해 feeder cell을 사용하지 않고, 0.1% gelatine solution [biological industry] 제품과 LIF [sigma] 를 이용하였습니다.
Gelatin coating의 경우 제품 사용 정보와 같이 면적에 충분한 solution을 넣었으며, 인큐베이터 (37도씨)에서 1h 정도 보관 후 gelatin solution을 suction하고 media를 넣고 cell을 seeding하였습니다. (혹시나 여기서 gelatin coating에 문제가 생길 수 있는 점이 있다면 말씀 부탁드립니다.)
Media 조성에 대해서는, 기존에 나와있는 논문을 그대로 참고하여 다음과 같이 제조하였습니다.
KnockOut DMD main media
1) 15% KnockOut Serum Replacement
2) 2 mM L-Glutamin
3) 1 mM MEM NEAA
4) 100 uM beta-mercaptoetanol
5) 1% P/S
6) 1000 unit/ml LIF
7) 1 uM PD0325901
8) 3 uM CHIR99021
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배지를 제조 하였을때, 전체적으로 색이 많이 노란색을 띄었습니다. 이 점 때문에, 배지가 이상한것이 아닐까 라는 생각을 했는데, 특정 세포를 배양할때 노란색을 띄는 배지를 사용하는 분이 계셨습니다. 그래서 이것도 들어가는 조성이 비슷한 부분이 있어 문제 없다고 판단을 했습니다.
(따로 걱정되는 것이 있다면, MEM NEAA같은 경우 100X로 제품을 판매하였는데, 회사 기술정보를 통해, 제품의 농도가 10 mM인것을 확인하고 10배 희석하여 1 mM농도가 되도록 배지를 제조하였습니다. 혹시 기존 제품의 농도가 10 mM이 아니라서 이렇게 배지의 색이 노란색을 띄고, 그로인해 세포에 문제가 생긴것인지 고민해봤습니다. 이 부분에 대해 MEM NEAA가 많이 들어가게 되면, 혹은 적게 들어가게 되면 배지의 pH가 변하는것에 대해 아시는분이 계시다면 조언 부탁드립니다.)
세포 상태의 경우는 드라이 아이스로 배송되자 마자, 액체질소에 보관하였습니다.
혹시 처음부터 세포에 문제가 있었을 가능성도 생각해 보았지만, 현재 배송된지 1달이 흘러버렸고, 판매 업체에서 제공하는 handling protocol을 그대로 따라 하지 않았기 때문에(feeder cell 사용하지 않아야함) 품질 보증을 받을 수 없을것 같습니다.
현재는 세포를 푼지 하루가 지났고, 아직 세포가 부착되어 있지 않아, gelatin coating을 다시 진행하고, 세포를 그대로 새로운 배지로 이동시키려고 합니다. (몇몇 정보를 보았을때는, 세포가 이미 죽었을거라는 글을 보았고, 조금 더 기다려보라는 식의 글을 보았습니다.)
만약 세포를 이동시켰을때도 부착되지 않는다면, 새로 구매를 진행해야 할 것 같은데,
이후 같은 문제가 발생하지 않기 위해, 여러 정보를 알아보고 다시 준비하려고 합니다.
이 글을 읽고 조언 부탁드립니다.
감사합니다.
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