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단백질의 유전자 동정
레벨1 화바바 (대학생)
안녕하세요. 제가 지금 연구계획서를 작성하기 전에 이론적인 실험법을 구상하는 중인데요. 생물을 배우기 시작한지 얼마 안된지라 배경지식이 너무 부족해서 가르침을 좀 구하고 싶습니다..ㅜㅜ
일단 연구과제의 전체적인 흐름을 간략히 말씀드리면
1 오염물질 x를 영양원으로 육성가능한 미생물 A주가 어떤 종의 미생물인지 동정
2 미생물A가 물질 x를 어떻게 분해하는지 해명하기 위해, x를 분해하는 데 필요한 단백질 Y를 코드하는 유전자 y를 동정
3 유전자 y로 이루어진 Y를 대장균으로 대량 생산
-> 오염물질 x를 효율적으로 제거
입니다.
지금은 시작 단계라 전체적으로 어떻게 진행할지를 정리하는 중인데요, 찾아보다보면 너무 구식인 방법이라던가 제가 알아내고 싶은 것과 다른 걸 알아내는 방법인게 많더라구요.. 그래서 혹시 이게 알맞은 과정인지 아닌지 확인 좀 부탁드리고 싶습니다ㅜㅜ
일단 1에서는 16s rRNA 시퀀싱을 하려고 합니다.
그 과정으로 16s rRNA를 코드하는 DNA를 추출해서 분리하고, 유니버설 프라이머를 설계해서 PCR로 증폭합니다. 이렇게 얻어낸 dna 단편을 sanger나 NGS로 염기서열을 알아내고, BLAST 같은 데이터베이스에 검색해서 비슷한 배열을 갖는 미생물을 조사해서 종을 특정합니다.
->여기서 궁금한 부분은, 제가 27F와 1492R의 프라이머 세트를 쓰려고 했는데 이 경우 16s rRNA가 너무 길어서 문제가 되나요? 찾아보니까 V3-V4 영역만 따로 잘라내서 증폭한다고 하는데 이 경우에 미생물을 종까지 특정 가능한가요??
2에서는 PMF법을 이용하려고 합니다.
먼저 물질 x가 풍부한 환경에서 미생물 A를 배양해서, 발현한 단백질 혼합물을 추출해서 SDS나 전기영동으로 각각의 단백질을 분리하고,
트립신 등 소화효소로 단백질을 분해해서 그 펩타이드 조각을 질량분석기로 스펙트럼을 분석해서, 단백질 분해 패턴을 테이터베이스랑 비교검색해서 가장 가능성이 높은 단백질을 동정한다..
->pmf법에 대해서는 이 사이트(bric)의 다른 질문을 참고로 했는데요.. 단백질을 분해해서 어떤 펩타이드로 분해되는지 그 패턴을 질량분석기로 조사하는 건지, 혹은 펩타이드를 질량분석기로 분석해서 프래그먼트 이온의 스펙트럼 데이터를 얻어서 각 펩타이드가 뭔지 조사하고 그걸 다시 합쳐서 전체 단백질의 서열을 알아내는 건지를 모르겠습니다ㅜㅜ
그리고 물질 x가 풍부한 환경에서 미생물 A를 배양해서 생기는 단백질들을 다 조사한다고 해도, 어떻게 X 분해에 관련된 단백질을 알아낼 수 있는지 그 다음 방법이 검색해봐도 잘 나오지를 않아서 그 이상 구상을 못했습니다.. 제가 생각한 건 각 단백질을 일일히 분리해서 대량으로 생산한 다음에 X를 주입해서 분해하는 것들을 찾아낸다.. 인데요. 이게 어느정도 가능성 있는 얘기일까요? 조언 좀 부탁드립니다.ㅜㅜ
3에서는 2에서 알아낸 유전자 y 단편을 발현 벡터에 넣어서 재조합 DNA를 만들고, 이걸 대장균에 넣어서 배양해서 증식시키면 그 산물로 단백질 Y를 얻을 수 있을까 생각했습니다.(subcloning)
그래서 먼저 유전자 y용 프라이머를 설계해서 PCR로 증폭해서 유전자 y 단편을 준비하고(+제한효소 처리), 발현벡터에 ligation해서 재조합DNA를 만듭니다. 그리고 transformation으로 대장균을 배양해서, 크로마토그래피로 발현한 단백질을 정제합니다.
->발현 벡터에 대해 찾아보다 보니 삽입할 유전자의 길이에 따라서 플라스미드 벡터, 파지벡터 등등 여러가지를 사용하던데, 유전자 y의 길이가 어느정도일지 예측하는 것은 어렵겠죠??
여기까지 입니다. 지식이 부족한 채로 긴 글 올려서 죄송합니다..
길고 귀찮은 글이지만 너무 말이 안된다 싶은 부분이 있으면 꼭 지적 부탁드리고 싶습니다ㅜㅜ
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